研究背景： 睾丸癌是少数可以用药物治愈的恶性肿瘤之一，顺铂(cisplatin)是治疗睾丸癌的主要药物。此外，顺铂对卵巢癌、肺癌和头颈部癌等实体瘤都有很好的疗效，是多种肿瘤化疗方案中的组成药物。但是，顺铂在治疗肿瘤时往往因为肿瘤对之产生耐药性而疗效降低。至今为止，这种耐药性产生的机理仍未阐明。阐明肿瘤对顺铂产生耐药性的机理，对于减少耐药、提高顺铂的疗效、扩大顺铂的临床应用范围具有重要的指导意义。 细胞缝隙连接 (gap junction，GJ) 是细胞之间的一种蛋白质连接通道，广泛存在于实质性脏器(如心脏，肝脏，肾脏，中枢神经，皮肤，肌肉等)组织中。GJ 由特殊的通道蛋白—连接蛋白(connexin，CX)组成。6个Cx环绕在一起组成一个“半通道”(hemichannel，又称为连接子connexon)。两个位于各自细胞胞膜上的“半通道”对接在一起形成一个GJ。GJ提供了一种细胞与细胞之间的直接联系通道，是细胞之间信号传递的一种重要方式。GJ功能与结构的异常与许多疾病(包括肿瘤)的发生、发展有密切的关系。研究证明：在培养的正常细胞和肿瘤细胞，GJ能够增强多种化学毒物引起细胞凋亡的作用。我们和其它研究发现：顺铂的细胞毒性在GJ存在的情况下显著增强。 GJ影响顺铂等抗肿瘤药物细胞毒性的机理不明。顺铂等抗肿瘤药物的细胞毒性在有GJ存在的情况下增强这一事实表明，顺铂等在引起细胞凋亡(或坏死)的同时，诱导细胞产生了某种可以通过GJ传递的“死亡信号”；这种“死亡信号”通过GJ传递到毗邻的细胞，引起其它细胞死亡或加强顺铂的细胞毒性，这种现象称为“旁细胞效应”。我们推测，当GJ功能受到抑制时，顺铂诱导细胞产生的“死亡信号”不能通过GJ扩散到毗邻的细胞。这种“旁细胞效应”减弱或消失将会导致顺铂的细胞毒性降低。有报导，顺铂可以通过减少人成纤维细胞膜上的Cx数量而降低细胞间的GJ功能。因此我们推测：如果顺铂在杀伤肿瘤细胞的同时，能够抑制细胞的GJ功能，这将会导致它细胞毒性的降低，这可能是顺铂耐药性产生的一种机制。本研究拟在转染并稳定表达Cx26/Cx32的HeLa细胞上，通过观察顺铂对GJ 功能的作用，以及探讨这种作用与顺铂细胞毒性的关系来验证这一假设；此外，本研究还将深入探讨顺铂改变GJ功能的机理。 研究方法： 1．在转染并稳定表达Cx26/Cx32的HeLa细胞，用“标准细胞集落形成分析法”(standard colony-forming assay)和“SRB(sulforhodamine B)法”测定顺铂对细胞的杀伤作用(细胞毒性)。 2．用不同密度接种细胞的方法和加doxycycline诱导Cx表达的方法，获得有GJ形成和无GJ形成的细胞。用上述细胞，观察GJ形成对顺铂的细胞毒性影响。 3．用“细胞接种荧光示踪法”(Parachute Assay)测定培养细胞间的GJ功能；并观察顺铂对GJ功能的影响。 4．用“特殊转移分离法”(Transport-Specific Fractionation，TSF)测定顺铂对Cx通道的直接作用。 实验结果： 1．在有GJ形成和无GJ形成的细胞，顺铂(0.1—10μg/ml)作用1小时，能够浓度依赖性地降低细胞集落形成率。顺铂(7.5μg/ml)对细胞集落形成的最大抑制率分别为94％(无GJ细胞)和97％(有GJ)。在有GJ和无GJ细胞，顺铂(0.5μg/ml)均在连续作用6 h后产生细胞抑制作用；作用24h时细胞抑制作用达到高峰，此后不再增强。在有GJ的细胞，顺铂的细胞毒性显著大于无GJ的细胞。结果表明，在有GJ和无GJ的HeLa细胞，顺铂均能抑制细胞生长； GJ形成可显著增强顺铂的细胞毒性。 2．在细胞集落形成实验中，当顺铂浓度从0.1μg/ml增加至1μg/ml时，GJ增强顺铂细胞毒性的作用逐渐增加；但当顺铂浓度超过1μg/ml后，GJ增强顺铂细胞毒性的作用逐渐降低；顺铂浓度≥7.5μg/ml，GJ增强顺铂细胞毒性的作用消失。结果提示，较高浓度的顺铂能够降低GJ增强其细胞毒性的作用。 在SRB实验中，GJ对顺铂细胞毒性的增强作用，在顺铂连续作用6 h时最大，之后逐渐减弱。结果表明，顺铂持续作用超过6 h，能降低GJ增强其细胞毒性的作用。 3．细胞接种荧光示踪实验的结果显示，顺铂(0.1-10μg.ml)能够浓度依赖性地降低荧光示踪剂calcine通过GJ在细胞之间的传递，5μg/ml顺铂的最大抑制率为 80％，与2.3μg/ml 2-APB相当；顺铂抑制GJ的最小有效浓度为0.5μg/ml；超过5μg/ml，作用不再明显增强。结果表明，顺铂可以抑制Cx26/Cx32组成的GJ功能。 4．TSF测定的结果显示，顺铂浓度依赖性地降低分离纯化的Cx26/Cx32半通道的通透性，顺铂对Cx通道的抑制作用开始于0.1μg/ml，在5μ g/ml时达高峰，之后不再增强，表明顺铂能直接抑制Cx功能。 结论： 1．GJ能够增强顺铂的细胞毒性。 2．顺铂能够通过直接作用于Cx26/Cx32半通道，抑制GJ功能而导致其细胞毒性降低。 3．顺铂连续作用后，可能通过影响Cx的表达而减弱GJ功能，最终导致其细胞毒性降低，这可能与其耐药性的产生有关。