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益生菌是来源于宿主并对宿主健康有一定促进作用的微生物。许多研究表明,益生菌(主要是乳杆菌和双歧杆菌)具有抑制病原微生物、调节胃肠道健康、增强免疫应答、预防癌症、降血脂、降血压、抗突变和抗肿瘤等功能。西方国家对益生菌优良菌种的选育和功能的研究相对较多,多种益生菌产品已投放市场,但也存在着技术性能不高、机理不明、安全性评价不够等问题。欧洲最大的科学家合作项目PROEUHEALTH,旨在开发新型的微生态制剂以促进人体健康,目前正在进行中。我国虽然也有益生菌产品问世,对部分菌种的抑菌性能也进行了研究,但对于优良菌种的选育、各种益生功能机理的研究、技术性能和安全性能评价等工作目前明显落后于欧洲。我国以及亚洲地区面临着高血压的严重威胁,降血压功能的益生菌研究才刚刚起步。筛选来源于人体的安全性高的益生菌菌株并研究其潜在的降血压等功能,对于开发新的益生菌产品促进人类健康具有重要的现实意义和广阔的应用前景。
本项研究选用来源于健康青年和儿童肠道的乳杆菌和双歧杆菌,一方面筛选具有潜在降压功能的菌株,另一方面筛选能够耐受胃肠道低pH和胆汁盐性能的菌株,研究菌株抑菌性能。采用分子生物学的方法进行乳杆菌和双歧杆菌的筛选和鉴定,相对传统微生物学方法更快速便捷,可以直接鉴定到种。实验研究的乳杆菌和双歧杆菌来自于健康人群肠道,安全性能高于其他来源的益生菌。
首先通过选择性培养基平板涂布法筛选得到若干乳杆菌和双歧杆菌,经革兰氏染色选出阳性且形态特征符合乳杆菌或双歧杆菌的菌株。分别用乳杆菌和双歧杆菌特异引物将分离得到的细菌总DNA进行PCR扩增,如得到1500bp左右双歧杆菌特异片段或500bp左右乳杆菌特异片段,即可进一步确认。对其16S rDNA PCR产物进行DNA测序,将测序结果进行序列分析并提交GeneBank获得序列号(ACCESSION NUMBER),从而鉴定到种,用于进一步的实验。
在人体血压调节中,ACE(血管紧张素转化酶)起着重要作用,一旦ACE水平过高,将引起血压的升高,因此,抑制了ACE的活性,将能达到降血压的效果。体外实验表明,许多乳杆菌均具有潜在的降血压作用。40株乳酸菌菌株中有27株表现出抑制作用。其中尤以L. Salivarius La5、L. Salivarius Lma1、L. Plantarum LP529、L.plantarum LS12、L.plantarum LS31、L. Helveticus ZL51 这6株最为明显,具有很好的抑制效果。
进一步对这6株菌的耐酸、耐胆盐、耐药性能以及抑菌性能进行评价。其中L. Salivarius La5和L. Salivarius Lma1两株唾液乳杆菌对于酸和胆盐没有拮抗作用,对酸和胆盐非常敏感,活菌大量死亡,不能耐受人体内胃酸和胆汁的影响,起不到实际的降血压作用,因此不能作为食品添加剂或口服药。而其他4株菌的耐酸、耐胆盐性能不错,具有进一步开发的潜力。而菌株的抑制ACE活性与耐酸和耐胆盐之间也没有相关性。6株菌对大多数的抗生素均表现出敏感敏感,仅对少数抗生素产生耐受。菌株之间在对个别的抗生素的敏感性有差异。所有6株菌株对指示菌都有抑制作用,只是瑞士乳杆菌L. Helveticus ZL51的抑制效果最差,而且同一菌株对不同指示菌以及不同菌株对同一指示菌的抑制效果均有差异。
综合考虑,L. Plantarum LP529、L.plantarum LS12、L.plantarum LS31、L. Helveticus ZL51 这4株菌株可以作为备选菌株,应用于降血压产品的研究开发。