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目的外泌体在肿瘤的发生发展中发挥重要作用,包含的多种内容物也可对细胞起到不同的作用,可调控多种信号通路。作为机体抵御病原体及抗肿瘤的第一道防线,天然免疫受体TLRs激活后,可启动下游信号通路的活化,调控多种细胞因子等的表达,对肿瘤的发生发展起着重要作用。本研究利用肝癌细胞来源外泌体,首先分析其对肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移等生物性能的影响;以及其对肝癌细胞中天然免疫受体TLR8及其信号通路相关分子、下游细胞因子表达的调节作用;还考察TLR8激动剂ssRNA40作用后,肝癌细胞中TLR8的激活对肝癌细胞外泌体分泌的影响情况,从而初步探讨肝癌细胞中外泌体和TLR8的相互作用,阐释其对肝癌增殖转移的影响。方法1.细胞划痕试验检测肝癌细胞来源外泌体对肝癌细胞侧向迁移能力的影响HepG2和SMMC-7721细胞接种到12孔板中,至融合度达到90-95%,利用20μL的枪头制作划痕。利用不同浓度的肝癌细胞来源外泌体(10、20、30和40μg/mL)分别作用于不同肝癌细胞24h后,于0h和12h在同一位点拍照,利用软件Image J分析肝癌细胞“伤口”愈合率的变化情况。2.Transwell试验检测肝癌细胞来源外泌体对肝癌细胞迁移和侵袭能力的的影响不同浓度的肝癌细胞来源外泌体(10、20、30和40μg/mL)分别作用于HepG2和SMMC-7721细胞24h后,收集细胞,利用无血清培养基制成细胞悬液(2×10~5个/mL),取200μL分别加入含基质胶和不含基质胶的小室中,下室加入含10%胎牛血清的细胞培养基,继续培养24h后,进行细胞固定染色,显微镜下随机选取5个视野拍照进行细胞计数。3.细胞增殖试验检测肝癌细胞来源外泌体对肝癌细胞的增殖能力的影响不同浓度的肝癌细胞来源外泌体(10、20、30和40μg/mL)分别作用于HepG2和SMMC-7721细胞24h后,收集细胞,接种于96孔板,继续培养24h后,加入细胞培养液100μl和CCK-8液体10μl,继续培养2h,于490nm波长检测光密度值(OD)。4.实时荧光定量PCR、Westeron blot和ELISA检测肝癌细胞中TLR8及其信号通路相关分子、下游细胞因子的表达变化实时荧光定量RT-PCR和Westeron blot法检测TLR8、MyD88和NF-κB分子的mRNA转录水平和蛋白表达水平的变化情况,ELISA检测信号通路下游相关细胞因子的表达变化。5.TLR8特异性激动剂ssRNA40对肝癌细胞外泌体分泌的影响分别将不同浓度的ssRNA40(0.5、1、2和4μg/mL)作用于HepG2和SMMC-7721细胞24h后,利用SBI试剂盒提取细胞上清中外泌体,利用Bradford法和乙酰胆碱酯酶活力检测试验检测外泌体的变化情况。结果1.不同浓度的肝癌细胞外泌体(10、20、30和40μg/mL)分别作用于Hep G2和SMMC-7721细胞24h后,Hep G2和SMMC-7721细胞的侧向迁移率明显增高(P<0.05),并且随着TEXs的浓度增加而增强。2.与空白对照组相比,加入外泌体后HepG2细胞迁移数量明显增多(P<0.05);同时细胞的侵袭能力也显著增强(P<0.05)。3.不同浓度的肝癌细胞来源外泌体作用于Hep G2和SMMC-7721细胞24h后,与空白对照组相比,肝癌细胞的增殖没有显著变化(P>0.05)。4.不同浓度的TEXs作用HepG2和SMMC-7721细胞后,与空白对照组相比,肝癌细胞中TLR8及其信号通路上的蛋白分子MyD88和NF-KB的mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。Western blot结果显示,TLR8、MyD88和NF-KB的蛋白表达水平也明显升高。ELISA结果显示,TLR8信号通路下游细胞因子TNF-α和IL-6的表达水平显著增加(P<0.05)。5.不同浓度的ssRNA40(0.5、1、2和4μg/mL)作用HepG2和SMMC-7721细胞后,与空白对照组对比,实验组外泌体的分泌量显著减少,并且随ssRNA40作用浓度的增加而减少。结论1.肝癌细胞来源的外泌体可增强肝癌细胞的迁移和侵袭能力,并可激活细胞中TLR8受体,上调TLR8信号通路TLR8/MyD88/NF-KB关键分子MyD88和NF-KB的表达变化,引起下游相关细胞因子的表达变化。2.TLR8特异性激动剂ssRNA40作用肝癌细胞后,可以显著抑制肝癌细胞外泌体的分泌水平。3.综合以上结果,推测肝癌细胞中外泌体和TLR8可能存在相互作用,并且这个相互作用可能与肝癌细胞的侵袭迁移相关,对肝癌细胞的侵袭迁移具有调控作用。以上这些研究结果的取得,将为进一步理解肝癌的发生发展提供实验基础和依据。