第一部分CCL2基因慢病毒载体的构建目的:构建趋化因子配体2(chemokine(C-C motif)ligand 2,CCL2)基因的慢病毒表达载体,为研究该基因对白血病细胞的生物学作用奠定基础。方法:1.利用聚合酶链式扩增(PCR)技术,扩增出CCL2基因的CDS区,与p MD19载体进行连接,阳性克隆送至公司测序。2.利用基因重组技术构建慢病毒载体质粒CCL2-PLVX,利用PLVX、PLP-VSVG、plp1、plp2慢病毒质粒包装系统,在293T细胞中采用磷酸钙沉淀法包装CCL2慢病毒后侵染THP-1细胞,提取基因组DNA为模板,PCR扩增CCL2基因。结果:所获CCL2基因经测序与Gen Bank比对序列一致。慢病毒载体质粒CCL2-PLVX经双酶切鉴定片段大小正确。包装的慢病毒颗粒侵染THP-1细胞后,CCL2基因成功插入细胞基因组DNA中。结论:成功构建带有CCL2基因的慢病毒载体,为进一步研究CCL2基因对白血病细胞的生物学作用奠定了实验基础。第二部分CCL2基因在白血病细胞中稳定表达及其生物学功能研究目的:CCL2在白血病细胞株THP-1稳定表达后,观察CCL2对THP-1细胞增殖、凋亡、迁移、细胞周期及细胞耐药性的影响,初步探讨CCL2基因在白血病细胞中的生物学功能。方法:将实验细胞分成三组:未转染组,空载体转染组以及CCL2转染组。1.CCK-8试剂测定细胞活力,绘制生长曲线,观察CCL2对THP-1细胞增殖的影响;2.利用FCM检测CCL2对THP-1细胞周期的影响3.用2种化疗药物(柔红霉素、高三尖杉酯碱)作用THP-1细胞24h,CCK-8法检测细胞活力,观察CCL2基因对药物敏感性的影响;4.加入100ng/ml浓度的CCL2重组蛋白,观察CCL2对THP-1的趋化作用;利用Transwell小室观察三组细胞的迁移和侵袭能力。5.收集侵袭实验中上下室的培养上清,Elisa检测CCL2蛋白浓度。6.不加/加入100ng/ml浓度的CCL2重组蛋白处理THP-1细胞24h,收集细胞做迁移RT2 profiler PCR array实验,初步探讨CCL2影响迁移的机制。结果:1.CCK-8法绘制生长曲线,CCL2转染组与对照组(空载体载体转染组及未转染组,下同)的细胞增殖无明显差异(P>0.05);2.FCM检测三组细胞周期发现,CCL2的表达对细胞周期无显著影响(P>0.05);3.加药结果显示,CCL2不影响THP-1细胞对柔红霉素、及高三尖杉酯碱的药物敏感性;4.通过迁移和侵袭实验我们发现,CCL2重组蛋白可以增强THP-1细胞的迁移能力和侵袭能力;CCL2转染组细胞的迁移能力与对照组无明显差异(9.293±0.302 Vs 9.187±0.526,p=0.77),穿膜能力明显低于对照组(1.702±0.537 Vs 0.520±0.255,p=0.026);5.侵袭实验中,转染CCL2组上室CCL2蛋白浓度显著高于下室(p<0.001);6.迁移RT2 profiler PCR array显示,CCL2重组蛋白处理THP-1细胞后,与对照组相比,EPX、SPP1、CCL2、CX3CL1和CXCL13的表达上调。结论:。1.CCL2定向趋化THP-1细胞的迁移,高表达CCL2的细胞通过自分泌样作用使其侵袭能力减弱;2.CCL2的表达对THP-1细胞的增殖、周期及药物敏感性无显著影响第三部分CCL2干扰对白血病细胞的生物学影响目的:干扰CCL2在白血病细胞株HL-60的表达后,观察CCL2基因对HL-60细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响及相关机制研究。方法:1.利用慢病毒包装的方法将干扰效率最高的RNA链侵染白血病细胞株HL-60,验证CCL2基因在RNA水平和蛋白水平的表达。2.将实验细胞分成三组:未转染组,空载体转染组以及sh-CCL2转染组,使用CCK-8试剂盒测定三组细胞活力,绘制细胞生长曲线,观察sh-CCL2对HL-60细胞增殖的影响;2.通过FCM分析sh-CCL2对HL-60细胞周期的影响;3.利用表达谱测序技术,分析CCL2基因稳定沉默对HL-60细胞基因表达谱的影响。结果:1.RT-PCR和Western Blot验证CCL2表达水平成功下调。2.CCK-8法绘制生长曲线,sh-CCL2转染组的增殖速度明显低于对照组(空载体载体转染组及未转染组,下同)(p<0.01);2.我们采用FCM检测三组细胞周期发现,sh-CCL2沉默后细胞S期含量减少12%,G1期含量增加;3.测序结果显示,CCL2稳定沉默细胞与对照细胞间的差异表达基因共有159个,其中表达上调的基因58个,表达下调的基因101个,涉及细胞周期、TNF信号转导、NOD样受体信号转导、NF-κB信号通路等多个方面,RT-PCR和Western Blot验证CCL2沉默后,细胞内Cyclin D1的表达明显下调。结论:1.RNAi沉默CCL2后,白血病细胞HL-60增殖速度明显减慢;2.RNAi沉默CCL2干扰HL-60细胞由G1期进入S期,细胞内cyclin D1的m RNA水平和蛋白水平表达下降。第四部分CCL2/CCR2基因在急性白血病中的表达及其临床意义目的:探讨CCL2/CCR2基因在急性白血病(acute leukemia,AL)患者原代骨髓细胞中的表达情况及其与AL各项临床特征的相关性及预后意义。方法:病例来源于2012-2013年期间在苏州大学附属儿童医院诊断和治疗的急性白血病患者176例(初诊ALL66例,ALL缓解60例,初诊AML32例,AML缓解18例),20例同期非急性白血病作为对照。采用患者的骨髓标本分离单个核细胞提取总RNA,逆转录成c DNA,利用实时荧光定量RT-PCR方法检测CCL2和CCR2基因的转录水平,结合临床资料,分析其在AL中的表达及其与临床的相关性。结果:1.CCL2及CCR2在疾病的不同病程阶段表达水平不同。在ALL中,CCL2和CCR2的表达趋势一致,即初诊组低水平,完全缓解后表达增高至正常水平(PCCL2<0.001,PCCR2<0.001)。在AML中,初诊组CCL2的表达水平低于对照组(P<0.001),化疗后CCL2的表达水平无改变(P=0.462);CCR2在AML患者的表达水平与对照组无明显差异(P>0.05)。2.初诊AML患者CCL2和CCR2的表达水平高于初诊ALL患者(PCCL2=0.002,PCCR2<0.001);3.CCL2的表达水平高低与AL患者临床特征及早期治疗反应均无明显相关性。结论:初诊ALL患者骨髓幼稚细胞低表达CCL2和CCR2,随着病情缓解而恢复正常水平。