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动脉粥样硬化是一个慢性炎症过程,炎症反应参与其发生发展。金雀异黄素(GEN)具有抗炎活性,但作用机制尚未完全阐释。课题组前期研究显示GEN抑制活化炎症细胞的转录因子NF-κB,下调miR-21和TLR4表达,生物信息学分析发现miR-21与TIPE2 CDS区存在特异性结合位点。据此我们推测:NF-κB/miR-21/TIPE2信号轴在炎症细胞反应中扮演重要角色,GEN通过抑制NF-κB,下调miR-21表达,进而活化TIPE2,阻断TLR4信号转导,最终发挥抗炎作用。为验证上述科学假说,本研究用脂多糖(LPS)刺激RAW264.7细胞和THP-1细胞构建炎症细胞反应模型,LPS诱导C57小鼠血管慢性炎症反应构建动物模型。RT-qPCR检测LPS对炎症细胞miR-21、miR-155、miR-125a表达的影响。利用慢病毒构建稳定过表达和敲降miR-21细胞系,NF-κB抑制剂PDTC和GEN单独或联合处理细胞后再用LPS刺激,RT-qPCR、Western Blot、IF分别检测TNF-α、IL-6、MCP-1、i NOS、COX-2、NF-κB p65、miR-21表达,分析miR-21、PDTC对GEN抗炎作用的影响。不同浓度GEN处理巨噬细胞,CCK8和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒分别检测细胞活力及细胞外LDH含量,评价GEN对细胞活力的影响。RT-qPCR检测不同浓度或不同孵育时间的GEN对活化巨噬细胞miR-21表达的影响。构建miR-21宿主基因Vmp1启动子报告基因载体、NF-κB p65过表达载体并转染至巨噬细胞,双荧光素酶启动子活性报告基因实验分析NF-κB和GEN对Vmp1启动子活性的影响。利用慢病毒构建TIPE2稳定过表达和敲降细胞系,miR-21 mimic转染至细胞后再用GEN、LPS处理,RT-qPCR、Western Blot检测GEN对TIPE2、TLR4、MyD88、TRIF表达的影响及TIPE2对GEN生物学效应的影响,并分析miR-21对GEN调控TIPE2/TLR4的影响。双荧光素酶报告基因实验研究miR-21与TIPE2的靶向关系,并通过RT-qPCR和Western Blot进行验证。采用腹腔注射LPS联合胃灌注GEN、尾静脉注射miR-21拮抗剂,或腹腔注射LPS联合胃灌注GEN、皮下注射PDTC处理高脂饮食喂养的C57小鼠。分别通过RT-qPCR检测主动脉、外周血单个核细胞(PBMC)、腹腔巨噬细胞(PMΦ)的miR-21、iNOS、COX-2、NF-κB p65、TIPE2、TLR4、MyD88、TRIF表达,Western Blot、IHC、IF分析主动脉、脾脏、PMΦ炎症相关蛋白表达,HE染色观察脾脏形态学改变,生化分析仪检测血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇的含量并计算动脉硬化指数,探索GEN、miR-21和PDTC对小鼠血管慢性炎症反应的影响。结果显示,LPS能促进炎症相关因子表达,可用于构建炎症细胞反应模型,并上调炎症细胞miR-21表达。敲降miR-21后,活化炎症细胞的炎症相关因子表达水平明显降低,而过表达miR-21可恢复其表达。同时,过表达NF-κB p65能增强miR-21宿主基因Vmp1的启动子活性,而PDTC作用与之相反,且PDTC能显著下调活化炎症细胞miR-21及炎症相关因子表达,然而过表达miR-21处理又可有效减弱PDTC对miR-21和炎症细胞反应的抑制作用。此外,实验浓度范围内的GEN不影响巨噬细胞活力,并以剂量、时间依赖的方式下调miR-21,过表达miR-21可明显抵消GEN对炎症细胞反应的抑制作用。高脂饮食喂养联合腹腔注射LPS能诱导小鼠血管慢性炎症反应,miR-21拮抗剂可有效减缓血管慢性炎症反应,并与GEN协同抑制炎症相关因子表达,降低血脂水平。此外,PDTC可增强GEN对活化巨噬细胞及血管慢性炎症小鼠miR-21、炎症相关因子表达的抑制作用。GEN虽能有效降低miR-21宿主基因的启动子活性,但过表达NF-κB p65又可显著减弱这一效应。GEN可上调血管慢性炎症小鼠TIPE2表达,并抑制TLR4、MyD88和TRIF表达,这一结果在活化巨噬细胞中得到证实。此外,敲降TIPE2能逆转GEN对炎症细胞反应的抑制作用以及对TLR4信号通路的阻断功能,而过表达TIPE2作用与之相反。虽然miR-21mimic可拮抗GEN恢复TLR4信号转导,但过表达TIPE2处理后又能明显减弱miR-21 mimic的作用。miR-21 inhibitor可促进TIPE2表达,miR-21 mimic作用与之相反,并能显著降低野生组荧光素酶活性。综合上述研究结果,可得出以下结论;(1)LPS通过NF-κB增强mi R-21宿主基因启动子活性,促进miR-21转录表达,激活炎症细胞反应。(2)GEN下调NF-κB减少miR-21表达,进而活化TIPE2,通过My D88依赖型和TRIF依赖型途径抑制TLR4炎症信号转导,发挥抗炎活性。