细胞自噬是广泛存在于真核细胞内的一种进化上保守的分解代谢过程。在酵母菌中,细胞通过包裹待降解物(如一些蛋白质,糖类,脂类和受损细胞器等物质)形成自噬体,然后送到溶酶体(液泡)中进行消化,最后释放到细胞质中进行循环利用。越来越多的文献报道,正常细胞维持内环境的稳定及其他生理活动都需要细胞自噬的参与。一但发育过程中细胞自噬不能正常进行,胚胎细胞的发育和分化会出现缺陷。另外,细胞自噬还与传染病、肿瘤和神经退行性疾病等疾病的出现有关。细胞自噬的形成和调节是一个多步骤且极其复杂的过程,许多自噬相关基因参与其中。除了受自噬相关基因的调控,参与内吞途径的Rab小G蛋白也被报道能够调控细胞自噬。如哺乳动物中已报道Rab5通过Vps34调控自噬体的形成。我们实验室报道了酵母中Rab5的同源蛋白Vps21及其模块蛋白的缺失影响细胞自噬,但其影响细胞自噬的具体机制还不清楚。最新的实验数据表明Vps21模块蛋白缺失可能影响自噬体的封口,进一步的研究发现Vps21及其模块蛋白的缺失影响PI3K复合体亚基Vps34的定位。已知Vps34在酵母中分属于分别调控细胞自噬和内吞途径的两类复合体PI3K复合体Ⅰ和Ⅱ,因此本文通过酵母双杂交等手段来探讨Vps21模块蛋白与PI3K复合体亚基之间的互作,希望能更进一步阐释Vps21模块蛋白与哪些蛋白互作及其在细胞中的功能。得到如下主要结果:1.Vps21模块蛋白缺失影响Vps34的定位,但Vps34的缺失不影响Vps21在PAS的定位首先,我们发现Vps21模块蛋白的缺失会导致Vps34大部分转移到液泡膜上,但Vps34仍能够定位到PAS上,并发生堆积。相反,在Vps21定位到PAS的基础上,我们观察了饥饿条件下Vps34的缺失对Vps21的影响,结果显示:饥饿条件下Vps34的缺失并不影响Vps21到PAS上的定位,这说明Vps21并不是通过Vps34招募到自噬体上的,意味着Vps21可能是通过其它蛋白来定位到PAS上的。据此推测Vps21模块蛋白可能与PI3K复合体的亚基之间存在互作。2.酵母双杂交检测到Vps21模块中的一些蛋白与PI3K复合体的亚基互作为了检测Vps21模块蛋白是否与PI3K复合体的亚基之间存在互作,我们首先用酵母双杂交进行检测。结果显示:Vps8、Vac1、Pep12、Vps39、Vps41、Vam3与Vps15都有互作,其中Vps8与Vps15互作较强;Vps8、Vacl、Vam3与Vps30都有较弱互作;只有Vps8与Vps34有互作。由此推测Vps21模块中的一些蛋白可能通过与PI3K复合体的亚基互作来调控细胞自噬。3.Vps8与Vps34在内体上互作且互作依赖于Vps21,另外,Vps8与PI3K复合体亚基共定位用双分子荧光互补以及GST pull-down实验进一步验证了 Vps8与Vps34之间的互作。Vps8与Vps34的互作可能受饥饿诱导。Vps8与Vps34的互作位置与主要分布于内体上的Atg21共定位,并且Vps8与Vps34的互作依赖于Vps21。进一步深入分析发现,Vps8的N端结构域缺失对Vps8与Vps34互作有影响。最后,Vps8与PI3K复合体亚基在自噬条件下存在共定位。根据这些结果,我们推测在自噬体形成的晚期阶段,Vps21模块蛋白可能主要通过Vps8与Vps34的互作招募一些其它蛋白来完成自噬体封口过程,但该假设还需要更多的其它数据来验证。