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唾液酸家族属于九碳的氨基糖类化合物，在动物和微生物体内广泛存在。N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)是唾液酸家族中最重要的成员，在食品和医疗领域具有广阔的应用前景:Neu5Ac可以作为婴幼儿奶粉的添加剂，促进婴儿智力发育和提高免疫力;Neu5Ac还可以作为抗流感药物的合成前体，其衍生物在治疗Alzheimer症和艾滋病方面具有显著的疗效。 本研究采用两步酶法催化廉价的底物N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和丙酮酸合成Neu5Ac。本文克隆表达了N-乙酰葡萄糖胺异构酶(AGE)来催化GlcNAc发生异构反应生成N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)，克隆表达了N-乙酰神经氨酸醛缩酶(Nal)来缩合ManNAc和丙酮酸生成Neu5Ac。本文中采用大肠杆菌E.coliRosetta(DE3) pLysS为宿主，pET-28a(+)为表达载体，分别克隆表达了来自Anabaena sp.CH1中的AGE(anAGE)、Synechocystis sp.PCC6803中的AGE(snAGE)以及来自E.coli K12中的Nal。当3个酶单独表达时，anAGE和snAGE的酶活分别为6.29U/mg、2.11U/mg; Nal活性为1.63U/mg。SDS-PAGE结果表明Nal在过表达时都是以可溶的形式表达;而anAGE和snAGE在E.coli内过表达时均主要以包含体的形式存在。为了简化发酵过程解决AGE外源表达时形成包含体的问题，本论文通过构建多顺反子质粒的方法在同一个pET-28a(+)质粒上共表达了AGE与Nal的基因。在第二个基因的前面添加SD序列构建pET28a-anAGE-Nal、pET28a-snAGE-Nal、pET28a-Nal-anAGE、pET28a-Nal-snAGE重组质粒。经IPTG诱导表达之后均同时表现出AGE与Nal的活性。多顺反子质粒构建中基因插入的顺序对酶的表达有很大的影响:当基因克隆位置靠近启动子时，酶活较高;而当酶的基因克隆距离启动子较远时，酶活较低。利用这一特性，构建的多顺反子质粒在表达AGE时成功解决了anAGE与snAGE在E.coli中异源表达时易形成包含体的问题。当anAGE与snAGE在多顺反子质粒上克隆位置距离启动子较远时，它们的表达量降低，从而有足够的时间折叠为正确的构象。共表达了AGE和Nal的双酶偶联重组菌均可以催化廉价的底物GlcNAc和丙酮酸直接合成Neu5Ac。在本文构建的4株双酶偶联菌株中，pET28a-Nal-anAGE-Rosetta得到了最高的产量:终产量为61.3g/l的Neu5Ac、有52％的底物GlcNAc被转化。本论文获得的Neu5Ac产量高于文献中报道的产量;而且双酶偶联菌株简化了发酵过程，全细胞催化的方法免去了添加ATP来激活AGE的酶活，从而可以大大地节约应用中的成本。