人白介素7(IL-7)于1988年确认并定位于染色体8q12-13。IL-7蛋白含有153个氨基酸,3个二硫键,3个N糖基化,1个0糖基化,体内骨髓基质细胞表达的IL-7为25-28kDa。人IL-7蛋白含有六个外显子,小鼠IL-7为5个外显子,分子量约为25kDa,人比小鼠多了第5个外显子和17个氨基酸。人IL-7主要由非造血基质细胞和上皮细胞产生,包括成纤维网状细胞,淋巴器官的T细胞区,骨髓基质细胞,主要组织相容性复合体,胸腺上皮细胞,肝和肠上皮细胞,内皮细胞等,并且树突状细胞和巨噬细胞也可产生少量IL-7,绝大多数器官包括大脑均表达IL-7。IL-7的受体丰富,几乎所有的外周T细胞均表达,IL-7通过IL-7R介导的反馈回路直接控制信号传导和激活。IL-7是免疫调节和免疫增强的重要细胞因子,在B细胞分化的某些阶段、T细胞和NK细胞的存活、发育和稳态等多方面都发挥重要作用。(1)在造血干细胞向淋巴细胞分化和T细胞的阴阳性选择中有重要作用,还可以使初始T细胞活化后经过多轮扩增变成效应T细胞。研究表明,IL-7能够增强CD4+效应T细胞作用,并促使具有IL-7受体的效应T细胞发展成为长期存活的记忆T细胞。IL-7通过增强Bcl-2和Mcl-1抗凋亡信号和抑制Bax与BIM等凋亡信号来保证T细胞能够长期存活。另外,IL-7也能促进记忆细胞反向分化成效应CD4+和CD8+细胞。(2)IL-7对于B细胞的发育也很重要,尤其是pre-prO-B细胞发育成B细胞。IL-7对B淋巴系细胞发育的作用首先是与分泌IL-7的骨髓基质细胞作用,在V、D、J重排过程中也发挥作用。IL-7使Ig u链成功表达,并与替代轻链、Igα和Igβ的信号亚单位结合形成B细胞受体(pre-BCR), pre-BCR促使一群大的pre-B细胞(pre-BIIcells)产生和扩增。IL-7介导CD127/IL-7R a和γc亚单位二聚体化后引起一系列的信号传导：JAK3/STAT5, PI3K/AKT, Bcl-2家族相关信号,也可轻微的活化RAS/MAPK和src家族激酶。恢复由一些感染性疾病或治疗所致的免疫系统损伤(如HIV感染使CD4+T细胞缺失,化疗或放射治疗后导致的某种血细胞的缺失)成为研究热点,如化疗后,促红细胞生成素用于恢复血红细胞,粒细胞集落刺激因子用于恢复粒细胞和巨噬细胞。动物实验和临床前研究均表明IL-7能够使感染或治疗等导致的T细胞损伤或免疫系统损伤得到重建和恢复。IL-7治疗可以提高免疫反应强度,尤其可以大幅度提高对低亲和性或弱的免疫原的反应,使其成为针对没有免疫原性或免疫原性很弱的肿瘤免疫治疗的潜在佐剂。CTP是人绒毛膜促性腺激素亚基(hCG 0)的羧基末端肽(C-terminal peptide, CTP),含有四个0-糖基化位点,与细胞因子融合,能够显著延长与其融合的蛋白分子的半衰期,并且对蛋白分子的活性影响小甚至可以增强其活性。CTP与促卵泡激素或生长激素融合的蛋白,在体内没发现免疫性,并且与促卵泡激素融合的蛋白已经在欧洲获得批号,融合CTP蛋白的生长激素也在进行二期实验。艾滋病、肝炎和结核病(HIV、HBV、HCV、TB)等慢性感染性疾病在我国甚至全世界都是严重的公共卫生问题；并且随着人口老龄化,肿瘤患病率越来越高。目前,IL-7针对慢性病毒性感染疾病、结核病和肿瘤治疗相关的临床试验多达27项,实验结果较为理想,具有广泛的应用前景。因此,我们开展了长效IL-7的表达和功能研究。本研究中(1)将IL-7与CTP蛋白融合,并对CTP进行了糖基化改造,提高IL-7蛋白的糖基化和分子量,延长其在体内的半衰期；并通过密码子优化,提高在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary, CHO)中的表达量；同时使用抗生素、甲氨蝶呤(MTX)等筛选阳性克隆；通过流式细胞仪从阳性克隆中筛选高表达细胞株。(2)扩大培养高表达细胞株,收集细胞培养上清,浓缩纯化IL-7-CTP蛋白。(3)进行IL-7-CTP蛋白对外周血单个核细胞(PBMC)和T细胞增殖效果的研究,并通过基因芯片对IL-7-CTP体外刺激PBMC后基因表达情况进行分析。(4)测定IL-7-CTP在小鼠的一株杀伤性T细胞(CTLL cell)上的活性以及在小鼠体内的半衰期。1. IL-7-CTP蛋白在CHO细胞中的表达GenBank中查到IL-7的mRNA序列,用linker蛋白将IL-7 mRNA的CDS区和CTP核酸序列连接,密码子优化后合成核酸序列,构建了真核表达载体pcDNA TM5/FRT, pIRES-CD20-IL-7-CTP和PCI-IRES-CD20-IL-7-CTP。使用脂质体将表达质粒转染进FLP-INTM-CHO、CHO-K1或CHO/dhfr-等细胞中,通过潮霉素B、G418和营养缺陷方式筛选到上百株阳性细胞株,使用流式细胞仪从上千万的阳性细胞中分选高表达细胞株,最终分选到两株CHO-K1细胞,表达量为10 mg/1/day。2. IL-7-CTP蛋白的纯化将筛选到的高表达细胞株放大培养,收集培养上清,采用硫酸铵沉淀、等电点沉淀等进行初步纯化,使用疏水层析、离子交换、Blue Sepharose、分子筛S-200等继续纯化IL-7-CTP,最后使用CNBr-CTP对分子筛纯化后的蛋白进一步纯化。经分子筛纯化后,得到的蛋白量比较少,混合后超滤浓缩,Western Blot结果显示至少有7条带,表明可能由于不同位点的糖基化产生了7个蛋白,此时的蛋白纯度约为10%；使用CNBr-CTP进行纯化,超滤浓缩后使用0.22 μm滤器除菌,ELISA方法测定IL-7-CTP的蛋白含量,使用比色法测定蛋白总含量,获得IL-7-CTP约8.77μg, ELISA测得纯度为83.2%。3. IL-7-CTP蛋白比活性测定IL-7-CTP和IL-7-RD (IL-7-RD为R&D公司购买的原核表达的IL-7,ED50为0.1-0.5 ng/ml,纯度97%)按照10ng/ml倍比稀释为11个梯度,各浓度细胞作用36小时后,使用promega的CellTiter 96 Non-radioactive Cell Proliferation Assay(MTT)试剂盒检测细胞增殖情况。经计算,测得IL-7-CTP的ED50为0.90 ng/ml,比活性为1.11×106U/mg; IL-7-RD的ED50为0.635 ng/ml,比活性为1.58×106U/mg.4. IL-7-CTP蛋白体内半衰期测定将2μg/只的IL-7-CTP和IL-7-RD腹腔注射到平均体重为15g的2组小鼠体内,收集不同时间点的血清,ELISA法测定血清中的IL-7的浓度,kinetical软件计算IL-7-CTP的半衰期(Half-time)为25.67小时,平均消除时间(MRT)为36.27小时；IL-7-RD的Half-time为5.79小时,MRT为8.17小时。IL-7-CTP较IL-7-RD的Half-time延长了约2.64倍,MRT延长了约为2.4倍。5.IL-7对PBMC增殖作用使用流式细胞仪和MTT试剂盒对两种IL-7对经PHA-P活化的PBMC作用,检测细胞增殖情况,结果表明两种IL-7均能使PBMC增殖,但是与IL-7-RD相比,IL-7-CTP在不同时间和不同浓度对PBMC增殖作用均较强。综上所述,本研究获得了数百株稳定表达IL-7-CTP的CHO细胞,两株细胞表达量达到了10 mg/1/day,建立了纯化IL-7-CTP蛋白的方法,测得IL-7-CTP蛋白ED50为0.90 ng/ml和半衰期为25.67小时,能够促进活化了的T细胞和PBMC增殖。