长期以来研究者试图以灭活的肿瘤细胞作为瘤苗来提高肿瘤细胞免疫原性，激活抗肿瘤的特异性免疫，但是未经修饰的野生型肿瘤瘤苗效果并不理想。于是研究人员对肿瘤细胞进行各种修饰，使瘤苗的免疫原性和抗肿瘤作用得到了进一步的提高；由于采用的策略不同，所修饰的瘤苗激发免疫反应的方式和强度也不同。已知T细胞介导的抗肿瘤免疫反应，特别是CTL作用，在抗肿瘤免疫中起主要作用，所以，抗肿瘤CTL作用在瘤苗的研究中也就倍受注重。但由于不同的肿瘤有不同的突变的CTL表位，CTL作用不具备通用性，且其分离和鉴定也极其繁琐。 热休克蛋白(HSPs)是一类广泛存在又高度保守的分子伴侣家族，近年来发现在热应激时能大量合成的HSPs在肿瘤抗原递呈中起着重要作用。某些HSPs具有结合肿瘤细胞内的肿瘤抗原多肽(CTL表位)形成HSP-抗原肽复合物的特性，该复合物可通过与抗原提呈细胞(APC)表面的HSP受体相结合而内吞进入APC。与通常的APC对外源性抗原的处理方式不同，此时的肿瘤抗原肽主要由MHC Ⅰ类分子以稳定的“HSP-多肽-MHC Ⅰ复合物”形式提呈在APC表面供CD8~+T细胞识别并活化，从而诱导抗肿瘤的特异的CTL反应。其中，具有代表性的是通常表达于胞浆中的HSP70。HSP诱导的特异免疫不是由于HSP的多样性，而是由于HSP结合了特异的多肽而呈多样性的HSP肽复合物。所以，热休克蛋白在瘤苗中使用具有独特的优越性：无需鉴定和分离肿瘤抗原，且不受肿瘤抗原的调变的影响；HSP还具有诱导DC成熟活化，促进分泌细胞因子，传递信号和增强肿瘤细胞免疫原性等作用，并已为临床和实验肿瘤治疗所证明。但是，现有的HSP全细胞瘤苗研究是基于HSP肽复合物分泌于瘤细胞外或瘤细胞死后释放的，这不利于HSP抗原肽复合物与专职APC膜上受体相互作用；同时，瘤苗细胞局部的免疫环境也会影响HSP诱导抗肿瘤特异的浙生工大学博d二学t之论文黄常新CTL反应，这些也许是应用HSP产生的抗肿瘤CTL反应的强度不能令人满意的重要原因。 近年发现的细菌或病毒所产生的一类蛋白，具有特殊的免疫原性而称之为超抗原，超抗原可不经APC处理而可直接活化T细胞，因其有强大而广泛的免疫激活作用而倍受关注，超抗原的抗肿瘤应用研究也取得了重要进展。马文学等将Cerb一B一2的跨膜区编码序列与金葡菌肠毒素A(SEA，一种典型的超抗原)编码序列融合，使之在细菌中表达，得到融合蛋白SEA一M。它能以跨膜区锚定在肿瘤细胞表面，因而限制了超抗原的MHCll分子结合端，减少了其对APC的损伤，降低了毒副作用，仍然能够发挥强大的免疫活化作用。但超抗原的免疫激活主要是非特异性免疫活化，并不针对特定的肿瘤抗原，而且单独、全身使用有诸多的毒、副作用。 基于上述的背景，我们设想能否用膜表达型HSP70基因修饰肿瘤细胞，将肿瘤抗原肤 (CTL表位)从肿瘤细胞内携带出来，与HSP70形成复合体共同表达在肿瘤细胞表面，提高局部HSP抗原肤复合物的浓度，从而利于APC的活化，促进机体产生特异性抗肿瘤免疫。同时设想以蛋白转染法将超抗原锚定在瘤细胞膜上，在瘤苗细胞周围产生的强大的免疫活化效应，使大量的淋巴细胞、APC细胞和细胞因子聚集在瘤苗细胞周围，打破局部免疫抑制，使肿瘤细胞周围的微环境更有利于产生特异性抗肿瘤免疫反应，包括激活特异性CTL。这样，瘤苗细胞表面的HsP与超抗原可以较好地发挥互补的特异性和非特异性免疫反应，产生协同的抗肿瘤效应。并可避免超抗原对免疫系统过度激活，减少毒副作用。 超抗原SEA的第227位上的氨基酸既是SEA的MHCn类分子结合区又是致吐功能位点，将该位点的天门冬氨酸突变为丙氨酸，既可降低超抗原与APC上MHcll类分子的结合力，达到减少超抗原对APC损伤之目的又可减少超抗原的其它副作用。故本课题拟对膜型超抗原SEA一TM定点突变，将第227位上天门冬氨酸突变为丙氨酸，制备膜型超抗原突变体一SEA一TM D227A代替融合蛋白sEA一TM锚定在瘤苗细胞表面，以进一步减小超抗原的毒副作用。 本课题研究目标为:通过基因转染使HSP70表达于小鼠黑色素瘤B16的细胞膜上;同时通过蛋白转染法，将突变的SEA一TM锚定于瘤细胞膜上，制备细胞膜表面双重修饰的瘤苗并研究其抗肿瘤作用和机理。研究内容包括:(l)构建HSP70的膜表达载体，转染肿瘤细胞后，筛选并扩增阳性克隆，制成HSP70膜表面表达的单修饰瘤苗;(2)将带有跨膜序列的超抗原sEA-TM用PcR方法定点突变，构建成其膜型超抗原突变体SEA一TMDZ”A的原核表达载体，进一步表达并制备膜型超抗原突变体蛋白。(3)将膜型超抗原突变体蛋白锚定于HSP70膜表面表达的肿瘤细胞上，制成双重膜表面修饰的瘤苗;(4)在小鼠移植瘤 7浙三工大学博门士学位论文黄常新模型上，分别使用单一和双重膜修饰瘤苗，观察瘤苗的抗肿瘤作用。 本研究分为三个部分:第一部分:细胞膜表面表达HSP70的瘤苗的制备及其抗肿瘤研究1、膜表面表?