脑苷脂为细胞膜上的一类重要的脂质分子,其中乳糖基神经酰胺和半乳糖基神经酰胺的半乳糖基3位羟基,可以被磺酰化修饰,形成磺酰化乳糖基脑苷脂(SM3),或磺酰化半乳糖基脑苷脂(SM4)。这些磺酰化的脑苷脂在细胞膜上的表达对细胞功能有重要的影响。催化这种磺酰基转移的酶主要是脑苷脂磺酰基转移酶(cerebroside sulfotransferase, CST, EC2.8.2.11),该酶能够催化活性硫酸分子上的磺酰基基团到脑苷脂的半乳糖基3位羟基上。本课题研究的关注重点在于脑苷脂经过磺酰化修饰形成的脑硫脂(Sulfatide, Sulfated Cerebroside)。我们课题组之前的研究表明磺酰化修饰的脑硫脂能够通过转录因子Sp1与Stat3影响整合素αV亚基基因的表达,通过整合素αV亚基参与肝癌细胞的转移。然而,脑硫脂如何影响整合素aV亚基的表达并参与到肝癌细胞转移的机制还不十分清楚,因此,在本实验室之前的研究基础上,研究和探讨脑硫脂对整合素αV亚基基因表达的影响及其可能的分子机制。研究分为以下两部分：第一部分：脑硫脂抑制miR-223基因的表达整合素αV亚基是非常重要的一类细胞表面粘附受体,参与细胞的转移。首先,在57例肝癌病例标本中检测整合素αV的表达情况,研究发现在57例肝癌标本中整合素αV表达量上调(48/57,84%)。进一步研究还发现,与癌旁组织比较,脑硫脂在肝癌组织样本中表达量也显著升高,且与整合素αV亚基的表达呈正相关性(r=0.425,P<0.01)。研究发现miR-223能够抑制整合素aV的表达,同时,近期的大量研究表明,miR-223在肝癌的发生过程中起重要作用。我们发现miR-223在57例肝癌病例中表达量减少(45/57,79%),并且miR-223的表达失调与肝癌细胞的迁移有重要联系：过表达的miR-223能够抑制细胞的迁移能力,而miR-223的抑制剂促进细胞的迁移。在裸鼠体内肝原位实验,也发现了miR-223高表达能够抑制肿瘤的生长和转移。miR-223在肝癌中的低表达和如何影响转移成为我们进一步研究的重点。研究发现脑硫脂可以减少募集到miR-223启动子区的乙酰化的组蛋白H3和转录因子C/EBPa,乙酰化的组蛋白H3的减少可能与受脑硫脂调控在miR-223启动子区MOZ的结合减少和HDAC1的结合增多有关,进而抑制miR-223基因的转录活性,起到抑制miR-223表达的作用,而对其甲基化修饰水平没影响。裸鼠体内实验发现,脑硫脂的合成酶(CST)过表达可以促进肝癌细胞在裸鼠体内的转移潜能,同时抑制了miR-223的表达。通过进一步生物信息学软件预测发现,转录因子Sp1有miR-223结合位点,并且在不同物种中与Sp1的结合位点都是保守的。通过mRNA和蛋白表达水平的检测以及双荧光素酶实验均发现,Sp1是miR-223的靶分子。前期实验已经证明Sp1可以结合到整合素αV的启动子区,进而调控其表达。所以,肝癌样本中miR-223表达量的下调,可能减少了对靶分子Sp1的抑制作用,进而增强了整合素αV的表达及其介导的细胞迁移,促进肝癌的发生和恶性程度。综上所述,本部分的研究发现了脑硫脂能够通过调控在miR-223启动子区MOZ的结合减少和HDAC1的结合增多,抑制miR-223基因启动子区组蛋白H3和转录因子C/EBPa的乙酰化,进而灭活miR-223基因的表达,并促进了整合素αV介导的肝癌转移。第二部分：脑硫脂与溴区包含蛋白1相互作用在SMMC-7721和BEL-7404细胞经过组蛋白去乙酰基酶抑制剂(TSA)处理以后,明显促进了整合素αV亚基的表达,我们通过实验发现脑硫脂能够影响转录因子Sp1的乙酰化水平。TSA处理增强了Sp1和乙酰化的组蛋白H3在整合素αV启动子区的募集。脑硫脂属于鞘糖脂,不具有直接的催化功能,脑硫脂如何能影响乙酰化的机制还不清楚,于是我们研究和筛选与脑硫脂相结合的蛋白。为了研究这种分子机制,SMMC-7721细胞经过裂解以后,裂解蛋白经过与固相交联的脑硫脂共同孵育,洗去不结合的蛋白以后,洗脱下结合蛋白进行SDS-PAGE电泳、经考马斯亮蓝染色,并且与脑苷脂结合的蛋白比较,选取有显著差别的蛋白条带,分子量约在130kDa大小,通过质谱分析,得到了溴区包含蛋白1(BRD1,Bromodomain-containing protein1)和配对两性螺旋蛋白(SIN3B, Paired amphipathic helix protein)2个蛋白,评分最高且与乙酰化功能相关。通过进一步实验,采用荧光基团bodipy与脑硫脂分子交联,这种荧光标记的脑硫脂与细胞孵育以后,细胞裂解蛋白与抗BRD1的抗体共沉淀,我们在沉淀物中检测到了荧光信号。通过免疫荧光共定位实验也显示脑硫脂可以与BRD1有共同的分布区域。此外免疫共沉淀实验发现BRD1也能与Sp1形成复合物。但是,我们发现SIN3B与脑硫脂结合比较弱,但可与BRD1和Sp1结合形成三元复合物。在染色质免疫共沉淀(ChIP)实验中,BRD1和SIN3B与Sp1形成的复合物能够结合到整合素αV启动子区,同时脑硫脂能够促进Sp1、BRD1和AcH3K9/14在整合素αV启动子区的结合。虽然SIN3B可以结合到整合素αV启动子区,但是脑硫脂对其结合的程度并没有影响。通过构建BRD1基因的截短质粒,双荧光素酶报告基因实验发现BRD1是通过其PHD功能区直接与Sp1相结合,而与脑硫脂的结合是通过BRD1的dN功能区。BRD1与细胞膜上的脑硫脂结合后受其调控,从细胞质转位到细胞核里,与MYST乙酰基转移酶家族MOZ结合进而促进细胞核内组蛋白以及Spl的乙酰化,因此对整合素aV的转录激活有重要意义。此外,Spl复合物成员中还包括HBO1、HDAC1和p300等在整合素αV的启动子区有结合位点。综上所述,本部分实验发现了脑硫脂能够与BRD1结合,促进BRD1的核内聚集,与MOZ的结合有利于组蛋白H3和Spl的乙酰化,促进整合素αV亚基基因的表达。