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第一部分裸鼠皮下种植性肝癌模型的建立目的：建立稳定的裸鼠皮下种植性肝癌模型,为下一步实验奠定基础。方法：取1.5×106个对数期Huh7肝癌细胞,分别种植于裸鼠皮下,共43只裸鼠。成瘤后从体重、大体形态,肿瘤生长情况,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),HE染色及免疫组化多方面进行其稳定性及病理学特征鉴定。结果：肿瘤成功率为97.7%,肿瘤生长迅速,成瘤组体重较对照组明显减轻,甲胎蛋白(AFP)基因及蛋白强阳性表达,细胞分裂明显。结论：成功建立稳定的裸鼠皮下种植性肝癌模型,成瘤率为：97.7%。第二部分AFP-shRNA-HIV、Granzyme B-LV183慢病毒载体扩增、筛选、鉴定目的：扩增、筛选、鉴定AFP-shRNA-HIV、Granzyme B-LV183慢病毒载体方法：扩增携带目的基因的慢病毒载体,并对Huh7肝癌细胞进行转染,通过荧光显微镜计算其转染效率,行RT-PCR检测计算转染后各组基因相对表达较量,根据2-ΔΔct法,计算出目的基因的沉默效率,从3个慢病毒载体中经RT-PCR法筛选出干扰效果达到70%的慢病毒载体进行下一步实验,并行Western Bloting检测比较AFP蛋白表达差异。另外通过G418筛选建立稳定Huh7-GrB肝癌细胞,并经RT-PCR、Western Bloting进行验证。两种PCR扩增产物进行测序验证。结果：扩增慢病毒载体的OD260/280=1.86,电泳结果条带清晰,AFP-shRNA-HIV3转染效率为68%,基因沉默效率为76.8%,AFP蛋白表达明显下降。GranzymeB-LV183转染Huh7肝癌细胞后,经G418筛选两周,RT-PCR检测,有基因表达。Western Bloting检测有蛋白表达,PCR产物测序结果正确结论：1成功筛选出干扰效果达70%以上的AFP-shRNA。2成功筛选出稳定的Huh7-Granzyme B肝癌细胞。第三部分AFP-shRNA联合GranzymeB基因对Huh7肝癌细胞的影响目的：研究AFP-shRNA联合颗粒酶B基因对Huh7肝癌细胞的影响及可能机制。方法：以实验2为基础,用AFP-shRNA慢病毒载体转染Huh7-GrB肝癌细胞,48小时后检测细胞上清液ALT、AST、AFP浓度,通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况,CCK-8法检测细胞增殖情况,RT-PCR检测AFP mRNA、Bel2mRNA、 Caspases3mRNA相对表达量,并与其他组进行比较。结果：各组上清液ALT、AST、AFP总体相比P均小于0.05,有统计学差异,各组两两相比,ASG组与KB、AS、GrB、KZL组相比P<0.05,有统计学差异,AS组与GrB组相比无统计学差异,KB组与KZL组相比P>0.05,无统计学差异；各组细胞凋亡总体相比P<0.05,有统计学差异,ASG组分别与KB、KZL、AS、GrB组相比P均小于0.05,有统计学差异；各组细胞增殖情况总体相比P<0.05,有统计学差异,ASG组与KB、AS、GrB、KZL组相比P<0.05,有统计学差异,KB组与KZL组相比P>0.05,无统计学差异,AS组与GrB组相比P>0.05无统计学差异；AFPmRNA、Bcl2mRNA、Caspases3mRNA相对表达量,各组总体相比P<0.05有统计学差异,ASG组与KB、AS、GrB、KZL组相比P<0.05有统计学差异,AS组与GrB组相比P>0.05,无统计学差异,但与其他各组相比均有统计学差异。结论：1AFP-shRNA联合GranzymeB基因处理肝癌细胞可以促进肝癌细胞凋亡、抑制肝癌细胞增殖。2AFP-shRNA联合GranzymeB基因处理肝癌细胞可以抑制其AFPmRNA、 Bcl2mRNA表达,促进Caspases3mRNA表达,促进肝癌细胞凋亡。3AFP-shRNA联合GranzymeB基因处理肝癌细胞促进其凋亡的机制可能有两方面：(1)抑制AFP、Bcl2表达,抑制肝癌细胞生长；(2)GrB进入肝癌细胞后在AFP-shRNA抑制AFP合成的情况下,大量激活Caspases3,从而抑制肝癌细胞耐药的产生,增强GrB的作用,导致肝癌细胞凋亡。第四部分AFP-shRNA联合GranzymeB基因对裸鼠皮下种植性肿瘤的影响目的：研究AFP-shRNA联合颗粒酶B基因对裸鼠皮下种植性肿瘤的影响及机制。方法：以第一部分建立的裸鼠皮下种植性肝癌模型及第二部分扩增的慢病毒载体为基础,实验分为5组,KBW组、ASW组、GrBW组、ASGW组、KZLW组,于成瘤后每天注射基因治疗,分别于3、6、9、15天测量肿瘤的长径及短径,并计算肿瘤体积,绘制肿瘤体积-时间生长曲线,于治疗后第15天脱臼处死裸鼠,行免疫组化检测AFP、Bcl2蛋白表达情况, RT-PCR检测AFPmRNA、Bcl2mRNA、 Caspases3mRNA相对表达量。Westren Bloting检测Bcl2、caspase-3蛋白表达情况。结果：ASGW组肿瘤体积与其他4组相比P<0.05,有统计学差异,肿瘤体积明显小于其他4组, AFP蛋白、Bc12蛋白、AFPmRNA、Bcl2mRNA表达明显低于其他4组,而Caspases3mRNA表达明显高于其他4组,Western Bloting结果显不ASGW组Bc12蛋白表达明显低于其他4组,Caspases3蛋白表达高于其他4组。结论：1AFP-shRNA联合GranzymeB基因肿瘤内注射能够明显抑制肿瘤生长。2AFP-shRNA联合GranzymeB基因肿瘤内注射可以抑制AFPmRNA、Bcl2mRNA表达、从而抑制AFP蛋白、Bcl2蛋白表达,同时促进Caspases3mRNA表达,促进肝癌细胞凋亡。3AFP-shRNA联合GranzymeB基因肿瘤内注射促进肝癌细胞凋亡的机制可能有两方面：(1)抑制AFP、Bcl2表达,抑制肝癌细胞生长；(2)GrB进入肝癌细胞后激活Caspases3,并在AFP-shRNA的作用下,抑制肝癌细胞耐药的产生,增强颗粒酶B的作用,导致肝癌细胞大量凋亡。