论文部分内容阅读
芥菜紫叶性状是由于叶片组织中花青苷的积累,紫叶性状可作为一种苗期形态学标记应用于杂交制种中,且其所含花青苷具有抗逆、抗氧化、抗增殖、抗突变、预防心脑血管疾病、抑制肿瘤细胞发生等多种功能。因此,成为蔬菜基因工程研究和新品种选育的热点。本研究在刘利艳（2015）构建的六世代遗传群体基础上,利用紫叶芥菜自交系（ZT-15-P）和绿叶芥菜自交系（ZT-15-G）重新构建分离群体,定位并克隆了1个控制芥菜紫叶性状的候选基因。主要研究结果如下:1.紫叶性状的遗传模式分析利用六世代群体,重新构建了15-F2A和16-F2B两个F2定位群体,并回交构建了BC5代近等基因系（NIL）。遗传分析发现,F2群体及BC各世代群体紫叶、绿叶性状分离结果经χ2检验分别符合3:1和1:1分离比,进一步证实芥菜紫叶性状受单显性基因控制,命名为Bj.Pur。2.连锁标记筛选与定位以白菜基因组为参考,在刘利艳（2015）对紫叶芥紫色基因初步定位的基础上,通过BSA法分别结合SSR、InDel及CAPS标记技术,利用15-F2A分离群体中的457个绿色单株作为定位群体,开发并筛选了453对引物,未找到表现稳定性差异的连锁标记。3.BSA-RNA-seq测序与分析选取F2群体中的紫色、绿色单株各30株,分别提取总RNA构建两个极端池进行转录组测序,并对转录组数据先后进行了2次分析:（1）芥菜基因组信息公布前,以白菜基因组（http://brassicadb.org/brad/）作为参考基因组进行分析,将控制紫叶性状的基因初略定位到A07染色体19.5-21M区间内,并找到1对与紫叶性状连锁的InDel标记ID001。（2）2016年9月芥菜基因组信息公布后,基于芥菜参考基因组（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/LFQT00000000）进行了比对效率统计、新基因鉴定、基因表达量及差异表达基因分析、差异表达基因功能注释和富集、BSR关联分析等一系列生物信息学分析,最终筛选出分别位于B2和B6染色体上的6个候选区域:B2:645778-822189,B2:14795886-28411252,B2:30951237-33131066,B6:17982970-18046596,B6:20817254-20923707,B6:22623041-22686844。4.候选基因鉴定、克隆及测序利用BLAST分析软件,对前期筛选到的与紫叶性状连锁的标记重新定位,将Bj.Pur定位在分子标记ID001（染色体位置B2:17.746M）右侧,遗传距离0.6cM。而后筛选出6个候选区域中与花青素合成代谢有关的基因,或光、温敏感型且表达量有显著差异的基因,结合分子标记定位结果,选取其中45个基因开发了63对标记,在亲本及F1间验证,结果发现由B02染色体上的Gglean060401基因（功能注释为MYB90,染色体位置:B2:17,903,639-17,904,826）开发的1对标记Bj-MYB90在亲本间具有片段长短多态性。对亲本进行Gglean060401基因的gDNA全长及CDS全长克隆并测序,gDNA全长扩增结果显示,紫叶芥亲本与参考基因组保持一致,而绿叶芥亲本相比于紫叶芥亲本,在第一个内含子区存在一段1268bp片段的插入,但两个亲本CDS序列无差异。推测该基因为控制芥菜紫叶性状的候选基因。5.确定Gglean060401（MYB90）为目的基因Bj.Pur将Bj-MYB90标记在15-F2A、16-F2B两个F2群体共计2229个绿色单株中验证,结果发现无交换单株,说明该标记与目标性状共分离。随后,又进行了紫、绿叶芥亲本中Gglean060401基因的q-RT-PCR表达量分析,结果表明,Gglean060401基因在紫叶芥中表达量为绿叶芥的89.6倍。上述结论进一步证实了Gglean060401基因即为控制芥菜紫叶的目的基因Bj.Pur。综上所述,叶用芥菜紫叶性状是由于转录因子Gglean060401（MYB90）在第一个内含子区缺失了一段1248bp的片段所造成的,Gglean060401基因即为控制芥菜紫叶的目的基因。