内生真菌裂褶菌和间座壳菌活性挥发物抑菌作用及其机制初探

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植物的内生真菌(Endophytic fungi)能够产生各种挥发性有机化合物(volatile organic compounds,VOCs),其中许多菌的挥发物具有特有的气味,并具有抑制病原菌生长的能力。目前对内生真菌VOCs抑制病原菌生长的机制研究较少。本研究在杨树上共分离得到174株内生菌,筛选出6株具有特殊气味的内生真菌,与实验室保存的3株具有特殊气味的内生菌(分离自河北任丘杨树),共同鉴定为裂褶菌(Schizophyllum commune)。另外,来自海南的5株具有特殊气味的内生菌(分离自海南长春花和银合欢)被鉴定为间座壳菌(Diaporthe spp.)。为探究内生真菌VOCs对病原菌的抑制作用,利用这9株内生裂褶菌和5株间座壳菌,对其VOCs的抑菌能力进行探究。并从中分别筛选出对病原菌具有良好抑制能力的裂褶菌ROHY8225b2和间座壳菌FPYF3052,并经SPEM-GC-MS技术分析和鉴定了其挥发物的主要成分。同时对影响内生真菌产VOCs的条件进行了探究。最后,利用荧光染色法,研究VOCs对病原菌的抑菌机制,确定了其对病原菌细胞的影响。研究主要内容及结果如下:1.在9株裂褶菌株系中,S.commune ROHY8225b2和S.commune 1-1-36的VOCs抑菌效果较好。其中S.commune ROHY8225b2的VOCs对炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、链格孢菌(Alternaria alternata)等抑制效果较佳,24 h内的抑制率均在64%以上,对葡萄座腔菌抑制率最高,达到77.5%。S.commune 1-1-36的VOCs对芦笋尾孢菌(Cercospora asparagi)、松树枯梢病菌(Sphaeropsis sapinea)、葡萄座腔菌抑制效果较好,24 h内抑制率均在74%以上,其中对尾孢菌的抑制率最高,达到97.9%。间座壳菌中D.apiculatum FPYF3052的VOCs在24 h内对葡萄座腔菌抑制率最佳,达到66.7%。在整个实验组,裂褶菌和间座壳菌的VOCs对供试病原菌的抑菌能力具有随着培养时间的增加而减弱的趋势。2.分析了D.apiculatum FPYF3052挥发性成分,测定共得到15种化合物,其中萜类含量极高,种类最多,其中γ-松油烯、α-松油烯和(-)-4-萜品醇的相对含量在8.4%-39.8%之间。分析了裂褶菌ROHY8225b2挥发性成分,测定共得到31种化合物,以萜烯类和酯类为主,其中β-红没药醇、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯是最主要的成分,其含量占比在8.8%-32.2%之间。对这几种单一成分进行了挥发性抑菌能力的测定,乙酸异戊酯和乙酸异丁酯和-4-萜品醇的抑菌效果表现最明显。3.温度、pH、氮源和碳源都是影响裂褶菌ROHY8225b2生长的因素。温度和氮源对裂褶菌ROHY8225b2的生长影响较大。在25°C~35°C范围内裂褶菌ROHY8225b2生长最快。而氮源为有机氮时,裂褶菌ROHY8225b2生长的最快。4.S.commune ROHY8225b2的VOCs对病原菌的细胞壁结构造成影响。实验组炭疽菌和链格孢菌部分菌丝尖端出现膨胀,刚果红在菌丝异常处着色加深;经SYTOX Green染色液染色后,实验组的链格孢菌呈现绿色荧光,其细胞膜出现受损,从而抑制病原菌的生长。S.commune ROHY8225b2的VOCs对链格孢菌和炭疽菌的孢子萌发在12h内呈现强烈的抑制作用,无萌发。
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