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第一部分：人胆囊癌细胞系GBC-SD中SP细胞的分离、鉴定目的在人胆囊癌细胞系GBC-SD中检测、分选SP细胞亚群,并检测该群细胞与干细胞相关的生物学特性。方法采用荧光激活细胞分选技术(FACS)从人胆囊癌细胞系GBC-SD中检测、分选人胆囊癌SP细胞、非SP细胞；利用Transwell侵袭小室模型检测SP、非SP细胞侵袭能力,通过MTT方法检测化疗药物对SP、非SP细胞生长抑制的影响；通过定量PCR检测SP、非SP细胞ABC家族中4种转运蛋白(ABCA2, MDR1,MRP1和ABCG2)的表达；通过流式技术分析SP、非SP细胞与4种干细胞标记物(CD24,CD34,CD44和CD133)的关系；利用体内、外成瘤实验检测两种细胞亚群的成瘤特性,并通过FACS检测新鲜人胆囊癌组织中SP细胞的表达。结果人胆囊癌细胞系GBC-SD中存在少量的SP细胞,约占总体细胞比例的0.87%；SP细胞较非SP细胞具有高的侵袭能力、耐药特性,并高表达ABC转运蛋白(P<0.05)；体内、外实验证明SP细胞具有强的致瘤能力,并可再生SP和非SP细胞,且再生的SP细胞的比例与分选前GBC-SD细胞中SP比例相似；7例人胆囊癌组织中也包含着不同比例的SP细胞亚群。结论人胆囊癌细胞系GBC-SD中SP细胞亚群具有类似干细胞的生物学特性。第二部分：TGF-β诱导的EMT对人胆囊癌SP细胞丰度的影响目的检测TGF-β诱导的EMT对人胆囊癌细胞系GBC-SD中SP细胞表达的影响,为下一步研究其机制奠定基础。方法在体外培养的GBC-SD细胞中加入TGF-、后,相差倒置显微镜下观察细胞形态学变化,通过RT-PCR、Western blotting检测E-cadherin、Vimentin mRNA和蛋白水平表达；并通过MTT检测发生EMT的GBC-SD细胞对3种化疗药物吉西他滨、米托葸醌和表柔比星的敏感性；通过FACS和定量PCR分别检测GBC-SD在TGF-β诱导下SP细胞比例的改变以及ABCG2 mRNA的表达。结果TGF-β可诱导GBC-SD细胞向间质型细胞形态转化,间质标记蛋白Vimentin mRNA和蛋白水平表达上调,上皮标记蛋白E-cadherin的mRNA和蛋白水平表达下调；且发生EMT后GBC-SD细胞对吉西他滨、米托蒽醌和表柔比星的IC50值分别增加倍8.1倍、40倍和5.7倍。GBC-SD细胞在TGF-β处理下,SP细胞的丰度以及ABCG2 mRNA表达均明显增加；撤除TGF-β诱导后,发生EMT转化的GBC-SD细胞逐渐恢复至上皮细胞表型。结论TGF-β诱导的可逆性EMT通过上调ABCG2依赖的SP细胞增加了GBC-SD细胞的耐药性,促进肿瘤细胞的干性转化。第三部分：TGF-β诱导GBC-SD发生EMT上调SP细胞丰度的机制研究目的初步阐明Smad3在TGF-β诱导GBC-SD细胞发生EMT上调SP细胞丰度过程中的功能。方法合成以Smad3基因为靶点的siRNA,并将其转染至经TGF-β诱导发生EMT的GBC-SD细胞。Western blotting检测Smad3-siRNA转染前、后发生EMT的GBC-SD细胞中Smad3和E-cadherin蛋白的表达水平,并通过FACS检测SP细胞亚群的表达比例。结果在TGF-β的诱导下,GBC-SD细胞中Smad3蛋白发生磷酸化；Smad3-RNAi转染至GBC-SD细胞后,Smad3蛋白表达降低；在TGF-β和siRNA联合作用下,SP细胞的丰度相对于无RNAi干扰组下调,而E-cadherin蛋白的表达相对于无RNAi干扰组明显上调。结论TGF-β-Samd3-E-cadherin间的信号传递促进了SP细胞的表达,Smad3基因在TGF-β诱导GBC-SD发生EMT上调SP表达的过程中发挥着关键的作用。