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为了明确玉米大斑病菌黑色素的合成与病菌致病性的关系,本文对玉米大斑病菌黑色素生物合成相关基因StPKS进行了克隆、生物信息学分析和功能研究,初步明确了StPKS在玉米大斑病菌黑色素合成途径中的作用及其与致病性的关系。根据已知植物病原真菌黑色素生物合成过程中的多聚酮合成酶基因PKS(polyketide synthase)的DNA保守序列设计引物,利用Genome Walking技术获得了StPKS的DNA序列及其侧翼序列,分别以玉米大斑病菌基因组DNA和cDNA为模板,通过PCR技术获得StPKS基因的全长序列。对DNA序列和cDNA序列进行对比分析,发现StPKS基因序列全长6527 bp,含有一个50 bp的内含子,具有完整的开放阅读框架,编码2158个氨基酸残基,蛋白的分子量约为232.6663 kD,等电点pI6.00;含有955个疏水性氨基酸残基和1203个亲水性氨基酸残基;包含完整的酮酰合成酶(KT)、酰基载体转移酶(AT)、酰基载体蛋白(ACP)结合位点、硫酯酶(TE)等保守结构域。生物信息学分析表明,其氨基酸序列与水稻胡麻斑病菌(Bipolaris oryzae)、玉米小斑病菌(Cochliobolus heterostrophus)、小麦褐斑病菌(Pyrenophora tritici-repentis)、小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)的PKS基因序列同源性分别为91%、89%、84%、79%。制备基因特异探针进行Southern杂交分析,发现StPKS基因在玉米大斑病菌基因组中以单拷贝形式存在。利用Genome Walking技术获得了StPKS基因5′端277 bp、3′端664 bp的非编码区,使用国际上通用的启动子分析软件Sofeberry、NNPP对其进行启动子活性区域分析,发现由起始密码子至上游约170 bp左右范围内有很强的启动子结构,其中在?17 bp处发现了1个TATA box等。构建了StPKS基因的双交换基因敲除载体,利用PEG4000介导法转化玉米大斑病菌的原生质体,经潮霉素筛选3代,共获得了50个阳性转化子,其中有4个菌株呈现灰白色菌落,经PCR验证有清晰的潮霉素扩增条带,然后分别对其进行Southern杂交分析,获得突变菌株。表型分析结果表明,突变体菌丝呈白色或灰白色,致病性丧失,证实StPKS基因与黑色素合成途径相关。本试验从基因克隆和基因缺失突变体分析进行了研究,为进一步明确玉米大斑病菌的致病机理,及在基因水平上研究黑色素途径对玉米大斑病菌致病性的关键作用提供理论依据,为新型杀真菌制剂的研制奠定了基础。