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目的：成骨活跃和骨转换加速是形成氟骨症多种骨骼改变的病理基础，其中成骨细胞（osteoblast, OB）功能活跃在慢性氟中毒的骨损害中发生较早，是起着主导作用的环节，而OB Ca2＋浓度升高可能是氟激活OB的启动机制之一。因此，研究氟作用条件下OB的Ca2+稳态变化在氟中毒发生机制研究中非常必要。迄今有关这方面尚缺乏系统的研究，OB内Ca2+浓度升高在氟骨症各种骨病变发生中的作用也还不十分清楚。本研究拟通过体内、体外实验，通过观察氟作用下OB及大鼠骨组织L型钙通道(Cav1.2)、钙泵（PMCA，NCS）及内质网膜IP3受体通道(IP3R)、钙泵（SERCAs）变化，研究氟作用条件下OB Ca2+稳态变化的机制；此外，将L型钙通道特异性拮抗剂硝苯地平作为干预手段，从mRNA水平、蛋白水平检测硝苯地平干预前后OB Cav1.2、成骨相关转录因子（c-fos, c-jun,runt-related transcription factor2(Runx2), osterix (OSX)）水平，从而阐明OB内Ca2+升高在氟骨症骨病变发生中的作用，同时探讨L型钙通道在氟作用下OB钙稳态维持中的角色，试图为氟骨症发生机制研究提供科学依据，为氟骨症的防治策略提供新靶点、新思路、新方法。方法：不同浓度氟(0、2、5、10mg/L F-)处理OB细胞株（MC3T3-E1细胞）48小时，以及SD大鼠饮水摄氟(100mg/L F-)2个月，通过实时定量PCR和Western-Blot检测细胞、大鼠骨组织Cav1.2、NCS、PMCA、IP3R、SERCA2b mRNA、蛋白表达水平，共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度(intracellular free calcium ion，[Ca2+]i)。此外，将不同氟浓度条件液(0、2、5、10mg/L)及L型钙通道拮抗剂硝苯地平(10μM)共同作用于MC3T3-E1细胞48小时，随后通过实时定量PCR和Western-blot检测Cav1.2，c-fos, c-jun, Runx2, OSX及共聚焦显微镜检测[Ca2+]i。结果：1.通过观察氟作用下OB细胞内钙离子浓度变化及质膜、内质网膜上钙通道、钙泵的表达水平，我们发现：1）氟作用下OB内钙离子浓度明显升高，且呈浓度依赖性；2）体外实验结果示：低氟浓度下(F5组,特别是F2组)，OB Cav1.2、NCS-1mRNA和蛋白水平均明显升高(P<0.05)，IP3R mRNA和蛋白水平明显降低(P<0.05)，ATP2A2mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)；高氟浓度下(F10组)，OBCav1.2、NCS-1mRNA和蛋白水平均明显减少(P<0.05)，IP3R mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)，但较低氟作用下表达增多(P<0.05)，ATP2A2mRNA和蛋白水平增加(P<0.05)，SERCA2b mRNA水平亦明显升高(P<0.05)。换言之，与C组相比，F2组[Ca2+]i浓度、Cav1.2、NCS-1表达都增加，而IP3R和ATP2A2表达水平降低；F10组[Ca2+]i浓度、ATP2A2、SERCA2b表达增加，而Cav1.2、NCS-1和IP3R表达降低；3）体内实验结果示：低氟浓度下(2组)，骨组织Cav1.2、NCS-1mRNA和蛋白水平均明显升高(P<0.05)，PMCA蛋白水平明显升高(P<0.05)，骨组织ATP2A2mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)；高氟浓度下(4组)，骨组织Cav1.2、NCS-1mRNA和蛋白水平均明显减少(P<0.05)，PMCA蛋白水平明显减少(P<0.01)，骨组织ATP2A2mRNA和蛋白水平增加(P<0.05)。换言之，与体内实验1组相比，2组Cav1.2、NCS-1和PMCA表达都增加，而ATP2A2表达水平降低；4组Cav1.2、NCS-1和PMCA表达降低，而ATP2A2表达增加。2.通过探讨L型钙通道在氟作用下OB钙稳态维持中的角色，结果显示：1）[Ca2+] i的水平以剂量依赖的方式随着氟化物浓度的增加而增加；2）低氟条件下，OB的Cav1.2mRNA和蛋白表达增加；高氟条件下，OB的Cav1.2mRNA和蛋白表达较少；加入硝苯地平后上述改变发生显著变化；3）低氟条件下，OB的转录因子c-fos和c-jun mRNA和蛋白表达增加；高氟条件下，OB的转录因子c-fos和c-jun mRNA和蛋白表达减少；加入硝苯地平后上述趋势发生显著变化；4）低氟条件下，OB的Runx2和OSX mRNA和蛋白表达增加；高氟条件下，OB的Runx2和OSX mRNA和蛋白表达轻度升高或减少；加入硝苯地平后上述改变发生明显变化。结论：1.氟作用下OB内钙离子浓度升高，且呈浓度依赖性；2.在低氟浓度下，OB内钙离子增多主要由于细胞膜钙离子通道开放所致，并通过质膜上的钙泵NCS、PMCA向胞外排放钙离子以维持细胞内钙稳态；3.在高氟浓度下，OB膜内流及外排钙离子减少，ER通过IP3R向胞内排放钙离子较低氟时增加，细胞内超载的钙离子主要通过ER膜上的钙泵ATP2A2、SERCA2b从胞内摄取钙离子以维持细胞内钙稳态；4.氟作用下的OB通过调节Cav1.2、NCS-1、PMCA、IP3R、SERCA2b/ATP2A2表达维持细胞内钙稳态，质膜及内质网膜上的钙通道、钙泵在氟作用下OB钙稳态变化中发挥重要作用；5.低氟浓度（<5mg/l，特别是2mg/l）下，OB Cav1.2、c-fos、c-jun、Runx2、OSX表达增加，成骨作用增强；而高氟浓度（102mg/l）下Cav1.2、c-fos、c-jun、Runx2、OSX表达相对减少，成骨作用相对减弱；6.硝苯地平干预后，氟作用下OB [Ca2+] i的水平、Cav1.2、c-fos、c-jun、Runx2、OSX表达显著改变，甚至发生逆转；7.氟通过L型钙通道影响OB钙稳态及成骨转录因子的表达，使OB成骨功能活跃，从而启动氟骨症进程。