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禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是一种寄主广泛的植物病原真菌,侵染小麦、大麦、玉米等重要粮食作物后,引发严重的赤霉病和根腐病。该菌除了直接致病引起作物产量损失外,还产生多种真菌毒素及次生代谢物质污染粮食作物,特别是脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON),严重威胁着人和动物的健康。因此,有必要深入研究该病的致病机理,以便提供更好的防治措施。Rab蛋白作为细胞内囊泡运输的分子开关,与其上游调控因子和下游特定的效应因子相互作用,并与GTP的结合和水解过程相偶联,在囊泡运输的不同阶段发挥功能。Rab家族蛋白可能通过调控囊泡的转运来影响禾谷镰刀菌生长发育及产毒致病等过程,但是尚无相关报道,本研究通过细胞生物学及分子遗传学的方法系统地分析了 Rab家族蛋白在禾谷镰刀菌生长发育及侵染致病等过程中发挥的作用,取得了如下结果:通过与酵母和人类数据库进行同源比对,我们从禾谷镰刀菌数据库中找到11 个假定 Rab 蛋白,分别命名为 FgRab1、FgRab2、FgRab4、FgRab51、FgRab52、FgRab6、FgRab7、FgRab8、FgRab11、FgRabX 和 FgYptA。首先我们系统研究FgRab家族蛋白的亚细胞定位,结果显示FgRab1、FgRab2和FgRab6主要定位于与胞吐过程相关的内质网、高尔基体、反式高尔基体等亚细胞器,FgRab8和FgRab1 1 主要定位于菌丝及孢子尖端;FgRab4、FgRab51、FgRab52、FgRab7、FgYptA等则主要定位于与胞吞过程相关的早期内涵体、质膜、液泡膜。进一步,我们运用潮霉素磷酸转移酶基因同源重组的方法获得了其中9个基因的敲除突变体,另外2个基因(FgRAB1和FgRAB11)无法获得敲除突变体,推测其基因缺失可能导致菌体死亡。同时,我们获得Fgrab11CA(组成型激活)及Fgrab11DN(组成型抑制)过表达菌株,但是多次重复实验无法获得Fgrab1DN(组成型抑制)过表达菌株。表型分析显示FgRab51、FgRab52、FgRab6、FgRab7、FgRab8主要参与调控营养生长、菌落形态、无性及有性繁殖、致病性、DON代谢及囊泡转运;而FgYPTA、FgRABX、FgRAB2、FgRAB4这4个基因的缺失对菌体的生长发育等表型没有影响。此外,我们发现FgRAB51和FgRAB52基因缺失突变体影响内吞过程,而且FgRAB52突变导致菌体细胞壁及细胞膜敏感性增加;FgRAB7基因缺失使突变体无法形成正常的液泡和自噬体;FgRAB8基因缺失突变造成菌丝和孢子尖端发生塌陷,而且影响极体标记蛋白FgSpa2的定位,说明FgRAB8对极性生长起着至关重要的作用。为进一步研究FgRab蛋白的作用机理及其所调控的信号网络,我们以FgRab8作为研究对象,进一步研究Rab8上游鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)、GTP酶激活蛋白(GAPs)及下游效应因子的生物学功能。Sec2p和Sro7p分别是酵母Sec4p/Rab8的GEF及效应因子,而Gyp1p及Msb3p具有水解Sec4p的GAP活性。通过同源比对获得禾谷镰刀菌中同源的FgSec2A/2B、FgGyp1、FgMsb3及FgSro7,基因敲除和表型及致病性分析结果显示FgSec2A、FgGyp1和FgMsb3对禾谷镰刀菌的生长、产孢及致病等过程至关重要。通过酵母双杂交实验,我们发现FgSec2A能够和FgRab8的DN状态互作,而与CA状态不互作,说明FgSec2A可能是FgRab8的GEF。但是酵母双杂交实验结果显示FgGyp1、FgMsb3及FgSro7无法与FgRab8的CA及DN状态互作,可能它们之间的互作较弱,后续需用pull-down、Co-IP或BIFC等其它方法进一步验证它们之间的互作关系。综上所述,我们的结果表明FgRab家族蛋白调控禾谷镰刀菌的生长、产孢、致病性及DON合成或运输等一系列过程,该结果将为阐明禾谷镰刀菌致病和产毒机制及研究其他物种Rab蛋白的功能提供分子策略。