【摘 要】
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犬细小病毒2（Canine Parvovirus type 2,CPV-2）是导致幼犬严重肠胃炎最常见的病原体之一。找到一种简单、准确、便携、廉价且适用于现场检测的CPV-2检测方法具有重要意义。Cas13a酶是一种RNA激活的核糖核酸酶（RNase）,在靶转录物与其结合后能够对crRNA进行加工和降解外源RNA。在本研究中,我们在原核表达系统中表达了 LwCas13a蛋白,并通过镍柱进行纯化。将
【基金项目】
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国家重点研发计划纳米科技重点专项（No.2017YFA0205301）； 国家自然科学基金项目资助（Nos.61971216,61527806 and 61871180）；
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犬细小病毒2（Canine Parvovirus type 2,CPV-2）是导致幼犬严重肠胃炎最常见的病原体之一。找到一种简单、准确、便携、廉价且适用于现场检测的CPV-2检测方法具有重要意义。Cas13a酶是一种RNA激活的核糖核酸酶（RNase）,在靶转录物与其结合后能够对crRNA进行加工和降解外源RNA。在本研究中,我们在原核表达系统中表达了 LwCas13a蛋白,并通过镍柱进行纯化。将CRISPR效应物Cas13a与重组酶聚合酶扩增（RPA）组合以建立分子检测平台,即为特异性高灵敏度酶促解锁（SHERLOCK）,可快速、灵敏地检测CPV-2 DNA。该系统具有高灵敏度和特异性。本研究旨在利用Cas13a系统,建立一种CPV-2病毒核酸现场检测方法。主要结果如下:1:收集由大肠杆菌表达的Cas13a蛋白并进行SDS-PAGE验证。IPTG用于蛋白诱导。2:为了检查Cas13a的活性和特异性,我们设计了两个阴性对照和一个实验组。结果表明,实验组荧光值显著高于阴性对照组,证明Cas13a蛋白具有RNase活性,且对靶标具有良好的特异性。3:为了提高检测灵敏度,引入RPA和T7体外转录以形成新的检测系统,经过优化其能够在30min内检测100 aM的CPV-2 DNA。因此,基于Cas13a蛋白的表达和纯化,本研究成功构建了一个对为具有对CPV-2 DNA具有良好灵敏性和特异性的检测系统。该技术可用于疾病爆发期间的CPV-2的现场检测。
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