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γ-氨基丁酸(GABA)能调节下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴减轻炎性反应,提高机体免疫力和生产性能。亚急性瘤胃酸中毒(SARA)产生的内源性脂多糖(LPS)能激活HPA,引起免疫应激,促进乳腺上皮细胞凋亡,降低产乳性能。GABA能否调节LPS引起的免疫应激改善SARA损害的产乳性能尚不清楚。乳腺上皮细胞的增殖和凋亡在乳腺发育和乳性能维持中发挥重要作用,本项目从细胞水平探讨GABA对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)增殖和凋亡的影响。首先,利用MTT、CCK-8与LDH方法检测了GABA对LPS诱导MAC-T细胞增殖的影响;其次,RT-PCR、Western blot和流式细胞术检测和分析炎性反应和凋亡信号的变化,评价GABA对LPS诱导MAC-T细胞炎性反应和凋亡的影响;最后,通过PI3K抑制剂(LY294002)处理MAC-T细胞,基于炎性分子与凋亡信号的变化,评价GABA对LPS诱导MAC-T细胞凋亡的分子机制,为改善反刍动物SARA时产乳量下降提供新的思路。结果如下:GABA能促进MAC-T细胞增殖,提高LPS诱导的细胞活力:GABA能促进MAC-T细胞增殖,且依赖于GABA浓度和作用时间,作用时间在12~36 h,浓度为50μmol/L时,能够显著促进MAC-T细胞增殖;GABA能显著提高LPS降低的MAC-T细胞活力,使LPS诱导增加的LDH释放量显著降低。提示GABA能促进LPS介导的MAC-T细胞增殖,降低细胞损伤。GABA减弱LPS诱导的MAC-T细胞凋亡:Annexin V FITC/PI结果显示,LPS引起MAC-T细胞凋亡数量增加,GABA能明显减少LPS诱导MAC-T细胞的凋亡数量,阻断GABA受体作用,GABA不能减少LPS诱导MAC-T细胞的凋亡数量;RT-PCR和Western blot结果显示,LPS提高促凋亡基因Caspase3、Caspase4和Bax的表达水平,降低存活基因Bcl-2的表达水平;GABA能逆转LPS对凋亡基因表达的作用,阻断GABA受体作用后,GABA不能逆转LPS介导MAC-T细胞凋亡基因的表达。提示GABA可能与其受体相互作用,降低LPS诱导的MAC-T细胞凋亡。GABA抑制LPS诱导的MAC-T细胞炎性反应:RT-PCR的结果表明,GABA能显著降低LPS激活的炎性信号分子(TNF-ɑ、IL-6、IL-8)的表达。Western blot结果显示,GABA能降低LPS引起的IL-6蛋白表达升高效应。GABA能显著降低LPS激活的TLR4/NF-κB信号通路关键因子(My D88和IRF3)的表达,阻断GABA受体作用后,GABA抑制NF-κB信号通路作用减弱。提示GABA可能通过其受体相互作用通过TLR4-My D88-NF-κB信号通路发挥抗炎作用。GABA调节LPS诱导MAC-T细胞凋亡的分子机制:PI3K抑制剂LY294002与LPS和GABA共同作用后,MAC-T细胞中TLR4/NF-κB与PI3K/AKT通路关键因子TLR4与NF-κB m RNA表达增加,促凋亡基因Bax和Caspase3 m RNA表达上调,IL-6、IL-8和TNF-αm RNA表达升高,而存活因子Bcl-2 m RNA表达显著下降。说明阻断PI3K/AKT通路后,GABA不能逆转LPS对凋亡基因和促炎因子表达的效应。提示GABA可能通过PI3K/AKT通路抑制LPS介导的MAC-T细胞凋亡,提高细胞的存活,抑制LPS诱导的MAC-T细胞炎性反应。