[目的]　　 目前肺癌是全世界癌症第一大死亡原因，其发病率和病死率逐年上升，且许多患者在确诊时已经处于肺癌的中晚期，失去了手术机会，因此化疗成为了中晚期癌症患者的主要治疗手段。随着化疗药物的不断应用，对化疗药物耐药的临床病例并不少见，给治疗带来了极大的挑战。非小细胞肺癌(Non-small-cellcarcinoma，NSCLC)包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，约80％的肺癌患者属于此类型。因NSCLC在肺癌中占了很大比例，如何治疗对化疗药物不敏感的NSCLC患者尤其重要。近年来，RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术在肿瘤治疗的基础性实验研究方面取得了较好的效果。本研究拟从基因治疗的角度出发，以RNAi技术下调人非小细胞肺癌A549、H460细胞中Bax抑制因子-1（Baxnhibitor-1，BI-1）基因表达，观察重组质粒（shRNA）对非小细胞肺癌BI-1基因、细胞周期、顺铂药物敏感性的影响，探讨体外逆转肺癌耐药策略。　　 [方法]　　 首先，运用CCK-8方法检测抗癌药物顺铂对非小细胞肺癌A549、H460细胞增殖的抑制效果，求算半数抑制浓度(IC50)。然后使用细胞培养技术，每天用顺铂刺激非小细胞肺癌A549、H460细胞株，IC50的顺铂浓度短时间0h、24h、48h、72h作用细胞;小剂量顺铂(0.5μM)长时间0d、7d、14d作用细胞，并在各时间点收集细胞，采用Real-Time PCR和Western Blot技术分别检测ABCC2、GSTP1、XRCC1、ERCC5等基因的mRNA及蛋白质表达。　　 其次优化重组质粒的转染条件:构建的重组质粒来自广东医学院分子生物学实验室，以pcDNA3.1(+)为载体构建的含T7启动子的shRNA真核细胞表达表达载体shRNA-BI1和阴性对照载体。BI-1基因最佳的干扰靶点为（BI-1，gi:23271944，73g-760位）。用LipofectamineTM2000(Lip)转染重组质粒至非小细胞肺癌A549、H460细胞内，并使用Real-Time PCR法检测shRNA-BI1重组质粒对BI-1基因表达的抑制效果，筛选转染复合物DNA(μg)与LipofectamineTM2000(μl)的最佳比例及作用时间，优化转染条件。shRNA-BI1质粒转染非小细胞肺癌A549、H460细胞后，运用CCK-8法检测转染前后抗癌药物顺铂对非小细胞肺癌A549、H460细胞增殖抑制效果的改变;流式细胞术(FCM)检测质粒干扰BI-1靶基因表达后对非小细胞肺癌A549、H460细胞周期的影响。　　 最后探索利用RNAi技术干扰BI-1靶基因表达后，非小细胞肺癌A549、H460对顺铂药物敏感性发生改变的原因。运用罗丹明123蓄积实验比较质粒转染前后ABC转运体的活性，Real-Time PCR法检测ABC家族相关基因的mRNA的表达水平。FCM技术检测GSH含量及SOD活性，Real-Time PCR法检测GSH、SOD代谢相关基因mRNA的表达。Western Blot技术检测BI-1调控肺癌耐药相关基因可能通过的信号传导通路。　　 [结果]　　 1.用Qnigin6.5软件拟合求算顺铂对非小细胞肺癌A549细胞50％半数抑制浓度(IC50)为（2.25±0.45）μM，H460的IC50为(0.97±0.45)μM。　　 2.观察小剂量顺铂(0.5μM)刺激非小细胞肺癌A549、H460细胞后，ABCC2、XRCC1、ERCC5等基因mRNA表达水平随着顺铂作用时间的延长而升高(P＜0.05)，蛋白质表达量也相应增加。而GSTP1的蛋白质及其mRNA表达量在顺铂的刺激下无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。　　 3.在6孔板中培养，A549细胞靶向BI-1的shRNA重组质粒（μg）与Lip.2000（μl）最佳量为4∶16，质粒与Lip.2000混合物作用细胞72 h后BI-1基因抑制率最低。H460细胞靶向BI-1的shRNA重组质粒（μg）与Lip.2000(μl)的最佳量为3∶8，质粒与Lip.2000混合物作用细胞48 h后BI-1基因抑制率最高。　　 4.质粒转染后，非小细胞肺癌细胞A549、H460顺铂的IC50分别为(1.04±0.59)μM、(0.54±0.10)μM，提示细胞对顺铂的药物敏感性增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。　　 5.干扰BI-1基因表达后，非小细胞肺癌细胞A549、H460的细胞周期显示:G1期表达减少，S期增多，呈现G1→S期停滞。　　 6.靶向BI-1的shRNA重组质粒能干扰阻抑非小细胞肺癌A549、H460细胞BI-1基因的mRNA及其蛋白质的表达。下调BI-1基因表达后，ABC转运蛋白超家族减少顺铂的药物泵出细胞外，ABCA3、ABCB1基因的mRNA表达水平明显下调(P＜0.01);GSH含量及SOD活性均下降，GCLC、GSS、SOD2等基因mRNA表达量明显下降(P＜0.05)。　　 7.BI-1激活PI3K-AKT、JAK1-STAT信号传导通路相关蛋白的表达。　　 [结论]　　 1.顺铂能上调ABCC2、XRCC1、ERCC5等基因mRNA及蛋白质的表达。　　 2.以pcDNA3.1(+)为载体构建的含T7启动子的shRNA真核细胞表达表达载体shRNA-BI1能干扰阻抑非小细胞肺癌A549、H460细胞BI-1基因mRNA及蛋白质的表达。　　 3.RNA干扰阻抑BI-1基因表达后能抑制非小细胞肺癌细胞A549、H460细胞增殖，并诱导凋亡。　　 4.下调BI-1基因表达水平后，能增强顺铂对非小细胞肺癌A549、H460细胞的药物毒性作用。　　 5.BI-1通过激活PI3K-AKT、JAK1-STAT信号传导通路相关蛋白的表达调控细胞的生长代谢。