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目的：近年来，发现尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase plasminogen activator,uPAR)参与多种肿瘤的调控，对肿瘤细胞的增殖和侵袭的意义引起了广泛关注。我们先前证明二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)可诱导人结肠癌SW480细胞增殖抑制与细胞周期G2／M期阻滞，其机制不明。本研究旨在研究DADS与沉默uPAR基因对人结肠癌SW480细胞uPAR表达及其信号通路的影响，以阐明其抗肿瘤细胞增殖、迁移与侵袭的分子机制。方法：根据uPAR基因序列设计miRNAl、miRNA2、miRNA3、miRNA4干扰序列，并设计1条非特异性序列作为阴性对照。将含靶向uPAR的miRNA的质粒pcDNATM6．2-GW／EmGFpmiR-uPAR转染人结肠癌SW480细胞，建立稳定细胞系，通过Westernblot验证其对uPAR表达的抑制作用:MTT比色法检测DADS作用和干扰uPAR后的SW480细胞增殖的影响；Transwell实验和划痕实验分别观察DADS作用和干扰uPAR后SW480细胞侵袭和迁移能力的改变；免疫组化检测DADS作用和干扰uPAR后的SW480细胞的uPAR的表达；RT-PCR、Westernblot分别检测DADS作用和干扰uPAR后的SW480细胞uPAR的mRNA与蛋白表达。Westernblot分别检测ERK、Fra-1、TIMP-3、MMP9、uPA的蛋白表达；RT-PCR分别检测TIMP-3和uPA的mRNA表达。RT-PCR、Western blot分别检测DADS作用SW480细胞vimentin和E—Cadherin的mRNA与蛋白表达。结果：1．DADS对人结肠癌SW480细胞uPAR蛋白表达的影响45mg·L DADS分别处理SW480细胞0、12、24、48 h后，Western blot结果显示，uPAR蛋白的表达水平呈时间依赖性下降。免疫细胞化学显示，uPAR蛋白在DADS处理0h组细胞胞膜和胞浆上表达呈强阳性，处理12、24、48 h后表达明显减弱。表明DADS可呈时间依赖性抑制SW480细胞uPAR蛋白表达。2．DADS下调uPAR对SW480细胞迁移与侵袭的影响划痕实验结果显示，DADS处理结肠癌SW480细胞0、12、24、48 h后，观察它们的划痕愈合情况，DADS处理0h组划痕愈合显著快于12、24、48 h组，证明DADS处理后SW480细胞迁移能力被抑制《P<0.05)，呈时间依赖性下降。Transwell实验显示，DADS处理SW480细胞后的体外侵袭能力被抑制，呈时间依赖性下降。3．RNA干扰uPAR对DADS抑制SW480细胞增殖、迁移与侵袭的影响pcDNATM6．2-Gw／EmGFPmiR—uPAR-miRN干扰质粒提取后琼脂糖电泳跑胶结果表示质粒提取纯度较高，倒置荧光显微镜下可见转染细胞发绿色荧光。Westernblot结果显示，与未转染组相比，转染uPAR-miRNA后SW480细胞uPAR蛋白表达降低(P<0．05)。Westernblot结果显示，转染uPAR-miRNAl的SW480细胞其uPAR蛋白表达水平与阴性转染组相比分别下降70．11％、18．12％、72．32％、15．32％，第3转染组对蛋白表达的抑制最明显(P<0．05)。后续实验均采用uPAR-miRNA3质粒作为实验对象。绘制生长曲线表明，48h后uPAR沉默组与未转染组和阴性转染组比较，细胞增殖明显抑制(P<0．05)，而未转染组与阴性转染组相比差异无显著性意义(P>0．05)。表明沉默组较未转染组和阴性转染组生长速度减慢。MTT结果显示，干扰uPAR表达可抑制细胞增殖。DADS处理沉默组细胞24h后发现，细胞增殖抑制率明显高于DADS处理的未转染组和阴性转染组(P(0．05)，48h、72h和96h后也是-样的结果，提示沉默uPAR可增强DADS的抑制细胞增殖作用。划痕实验结果显示，沉默组与未转染细胞组和DADS处理组作比较，取0h、24h和48h观察划痕愈合情况，沉默组和DADS处理组较未转染组划痕愈合显著变慢，证明沉默SW480细胞uPAR及DADS处理后的SW480细胞迁移能力被抑制(尸l<0．05)。Transwell实验显示，DADS处理和将uPAR基因沉默可降低人结肠癌SW480细胞的体外侵袭能力(P<0．05)。RT—PCR和Western blot和免疫组化结果均显示，沉默组和45 mg L。DADS分别处理未转染组、阴性转染组和转染组24 h后，uPAR表达均明显低于阴性转染组和未转染组(尸l<0．05)。表明DADS和沉默uPAR可抑制uPAR表达。4．DADS通过下调uPAR对ERKl-Fra-1-uPA信号通路的影响RT—PCR和Western blot结果均显示，uPAR沉默组和45mg L。DADS处理阴性转染组，ERKl、Fra-1、uPA、MMP-9表达均明显低于阴性转染组和未转染组(P<0．05)，而TIMP-3表达均明显增高(P(0．05)。表明DADS和沉默uPAR基因可抑制ERKl、Fra-1、uPA、MMP-9表达和上调TIMP-3表达。5．DADS与沉默uPAR基因对EMT的影响。Western blot和免疫细胞化学结果均显示，uPAR沉默组、45 mg L。DADS处理未干扰组与DADS处理干扰组较未干扰组vimentin表达明显降低，而E—cadherin显著升高(P(0．05)。表明DADS和沉默uPAR基因可下调vimentin和上调E—cadllerin。结论：1．DADS可下调uPAR抑制人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭。2．沉默uPAR基因可增强DADS抑制SW480细胞增殖、迁移与侵袭能力。3．DADS可通过ERKl-Fra-1-uPA／uPAR_MMP-9／TIMP-3信号通路下调ERKl、Fra-1、MMP-9、uPA、uPAR和上调TIMP-3抑制SW480细胞迁移与侵袭。4．DADS和沉默uPAR可下调vimentin和上调E—Cadherin逆转EMT。