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目的:1.探讨胰腺癌干细胞样细胞分离纯化、表型分析和生物学功能特性;2.探讨microRNA靶向调控胰腺癌干细胞样细胞生长增殖作用;3.探讨Hedgehog信号通路参与胰腺癌干细胞样细胞生长增殖调控机制。方法:1.选取手术后新鲜胰腺癌组织标本,提取和制备原代胰腺癌细胞,进行细胞体外扩增培养。肿瘤干细胞成球实验分离胰腺癌细胞中干细胞样细胞,并培养传代,采用HE染色、细胞免疫荧光鉴定。应用原代胰腺癌细胞制备裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型用以富集肿瘤细胞。RealtimeRT-PCR检测胰腺癌细胞干细胞关键因子的表达。构建质粒载体使筛选的关键因子启动子融合荧光蛋白转染原代胰腺癌细胞并再次建立裸鼠皮下移植瘤模型。流式细胞术(FCM)分析目标因子阳性表达细胞含量及所占比例并进行分选。通过MTT法测定细胞存活率,克隆形成实验测定细胞克隆形成效率来对比干细胞关键因子阳性和阴性表达细胞增殖情况,对比两种细胞的成球能力,并进行两种细胞裸鼠皮下移植成瘤率的对比。2.通过miRNA芯片分别检测干细胞关键因子阳性和阴性表达细胞中的mi-RNA变化并对比分析,筛选潜在与干细胞关键因子表达相关的miRNA,RealtimeRT-PCR分别检测胰腺癌组织标本和细胞株中的相关miRNA表达,通过扩增目的基因片段,及预测作用位点突变类型,分别构建入p GL4这个含有荧光素酶(Luciferase)的质粒形成载体,和miRNA共转染于人正常胰腺上皮细胞株HPDE6c7中,荧光素酶活性双报告基因检测方法明确所筛选的miRNA与相关目的干细胞因子的关系,寻找所筛选miRNA干扰胰腺癌生长的潜在靶基因。构建慢病毒载体重组转染所筛选的miRNA至目标基因阳性表达的胰腺癌细胞,从而上调所筛选的miRNA,通过RealtimeRT-PCR检测所筛选miRNA重组转染阳性细胞后其目标基因的变化,western blot检测所筛选 miRNA重组转染目标基因阳性细胞后其目标蛋白的变化。通过克隆形成实验测定细胞克隆形成效率,流式细胞仪分析细胞凋亡率,观察裸鼠成瘤率变化来判断所筛选miRNA干扰靶基因后胰腺癌细胞生长情况。Transwell侵袭实验检测重组转染目标基因阳性细胞组与对照组细胞的迁移和侵袭能力变化,免疫荧光和western blot检测重组转染目标基因阳性细胞组与对照组细胞肿瘤转移和EMT(上皮细胞-间充质转化)标志物的变化。3.MTT法和克隆形成实验测定重组SHH-N及SHH信号通道抑制剂cyclopamine对胰腺癌细胞生长率的影响,RealtimeRT-PCR反应检测经重组SHH-N及cyclopamine处理后的胰腺癌细胞中SHH信号通道相关因子和干细胞关键因子mRNA以及相关miRNA的表达结果,western blot法测定重组SHH-N及cyclopamine对胰腺癌细胞中MMPs及PI3K/Akt的影响。结果:1.消化人原发性胰腺癌组织样本,经处理后由小组织块爬出获得胰腺癌原代细胞,培养5至6天后倒置显微镜、相差显微镜中均可见细胞生长融合成单层贴壁细胞,融合度超过85%,细胞透明、细胞间紧密连接,具有连片能力。采用H&E染色观察胰腺癌原代细胞的形态学特征,可见原代胰腺癌细胞90%以上细胞融合贴壁,放大后细胞呈多边形,胞浆较宽,形态学检查结果表明实验获得胰腺癌干细胞样细胞具有自我增殖和多向分化的功能。细胞免疫荧光提示与其它干细胞关键因子C-myc、CD133相比Oct-4阳性表达最高。RealtimeRT-PCR检测显示胰腺癌细胞原代细胞和裸鼠移植瘤组织标本中,Oct-4、C-myc、CD133作为常用干细胞和肿瘤干细胞关键因子均呈阳性表达。其中相对于原代细胞,Oct-4在裸鼠移植瘤标本中阳性表达率较高。因此我们筛选了Oct-4作为胰腺癌干细胞样细胞的特异性标志物,通过构建质粒载体使Oct-4启动子融合YFP荧光蛋白,转染原代胰腺癌细胞并培养后再次建立裸鼠皮下移植瘤模型以富集肿瘤细胞。流式细胞仪分析结果显示Oct-4阳性表达细胞在原代胰腺癌细胞占2.79%,在裸鼠原代肿瘤皮下移植瘤模型肿瘤细胞中占7.84%,显著升高,P<0.05,其存活率、成瘤率、克隆形成以及肿瘤细胞成球能力均大于Oct-4阴性细胞,P<0.05。Oct-4阳性细胞成瘤能力大于阴性细胞。2.miRNA芯片检测显示Oct-4阳性细胞中miR-335表达量明显低于Oct-4阴性细胞。18组胰腺癌组织标本和细胞株中mi-335表达量也明显低于正常组织或细胞。Target-Scan显示Oct-4基因中可能存在mi-335干扰靶点。内源性mi-335增强剂与p GL4-OCT4-WT共转染细胞组中的荧光素酶活性比对照细胞组下降明显。与对照组相比,miR-335重组转染Oct-4阳性细胞组的Oct-4 mRNA和蛋白表达水平均下调,与对照组相比,miR-335重组转染胰腺癌Oct-4阴性细胞组中克隆形成能力下降明显,凋亡率明显上升,成瘤率明显下降,肿瘤细胞迁移和侵袭能力明显下降。与对照组相比,miR-335重组转染Oct-4阳性细胞组中,间充质标志物Fibronectin,Vimentin,α-SMA,和SNAIL1下调,上皮标志物E-cadherin上调。3.重组SHH-N可增加胰腺癌干细胞样细胞的生长率以及克隆形成能力,SHH信号通路抑制剂cyclopamine则抑制其生长率以及克隆形成能力。相对于对照组以及Oct-4阴性细胞组,经重组SHH-N处理后SHH通路各信号因子以及Oct-4在Oct-4阳性细胞中表达明显提高,而miR-335表达明显下降;经cyclopamine处理后SHH通路各信号因子仅有Smo表达在Oct-4阳性细胞中明显下降,其余信号因子表达下降不明显,Oct-4表达也有明显下降,而miR-335表达明显提高。重组SHH-N孵育24h可增加胰腺癌干细胞样细胞中MMP-2、MMP-9蛋白的表达,而cyclopamine可抑制MMP-2、MMP-9蛋白的表达;重组SHH-N孵育24h可增加胰腺癌细胞中Akt蛋白磷酸化的表达,cyclopamine则呈剂量依赖性减少胰腺癌细胞中Akt蛋白的磷酸化。可见SHH信号通路对PI3K/Akt信号通路具有调控作用,激活SHH信号通路可上调胰腺癌细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达增加Akt磷酸化,同时下调miR-335表达,促进Oct-4表达,从而影响了胰腺癌细胞干性特征,促进了肿瘤生长增殖。结论:1.通过分离培养胰腺癌干细胞样细胞,并建立裸鼠皮下移植瘤模型富集肿瘤特别是肿瘤干细胞,RealtimeRT-PCR及免疫荧光细胞化学检测鉴定标志物表达,筛选了胚胎干细胞转录因子Oct-4作为胰腺癌干细胞样细胞的特异性标志物,FCM分析阳性表达细胞含量及所占比例并进行分选纯化。通过测定细胞存活率、克隆形成效率以及裸鼠皮下移植成瘤率对比明确了Oct-4阳性细胞具有胰腺癌干细胞类细胞的生物学特性。2.miR-335表达量在Oct-4(+)细胞中明显低于Oct-4(-)细胞。胰腺癌组织标本和细胞株中mi-335表达量也明显低于正常组织或细胞。通过重组转染细胞过表达miR-335,可导致肿瘤细胞中Oct-4表达量明显下降,同时抑制了其增殖以及转移侵袭能力。从而明确了胰腺癌中miR-335可以通过靶基因Oct-4抑制肿瘤发生发展以及其干细胞样的特性改变,这可以作为一个潜在新的治疗胰腺癌方向。3.SHH信号通路通过PI3K/Akt信号通路介导的上调MMP-2、MMP-9表达和增加Akt磷酸化,同时下调miR-335进而影响Oct-4阳性表达,这一过程是对胰腺癌干细胞样细胞生长增殖进行调控的重要机制。