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昆虫嗅觉系统在其觅食、寻偶、选择产卵场所等过程中发挥着至关重要的作用,参与此过程的蛋白主要有气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)、化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)、气味受体(olfactory receptors,ORs)、气味降解酶(odorant degrading enzymes,ODEs)以及感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins,SNMPs)等。西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande),又名苜蓿蓟马,隶属缨翅目(Thysanoptera)蓟马科(Thripidae)花蓟马属Frankliniella,目前已成为世界性的危险性入侵害虫。本研究通过开展西花蓟马嗅觉相关蛋白基因克隆、时空表达、蛋白表达纯化、荧光竞争结合以及免疫定位研究,为西花蓟马更多嗅觉相关蛋白基因的发掘奠定基础,同时为阐明西花蓟马行为反应本质、与环境间的化学通讯提供理论依据。1.西花蓟马感器扫描电镜观察西花蓟马触角中的感器主要有毛形感器(sensilla trichodea)、刺形感器(sensilla chaetica)、锥形感器(sensilla basiconica)、乳状感器(mamillary sensilla);足上主要有毛形感器、刺形感器、锥形感器、吸耳球形感器(sensilla ear washing buob-shaped)、乳突感器(mamillary sensilla)、钟形感器(sensilla campaniform)、B?hm氏鬃毛(B?hm bristle);复眼上只有1种刺形感器。2.西花蓟马嗅觉相关蛋白基因分子克隆成功克隆获得4个西花蓟马嗅觉相关蛋白基因c DNA序列全长和1个基因c DNA序列片段,分别命名为Focc CSP1、Focc CSP2、Focc OBP1、Focc OBP2、Focc OR1,Gen Bank登录号分别为KM527949、KM035415、KM527948、KM527950、KM527951。Focc CSP1、Focc CSP2、Focc OBP1、Focc OR1全长c DNA序列分别为597bp、521bp、660bp、1645bp,开放阅读框分别为288bp、387bp、450bp、1374bp,分别编码95、128、149、457个氨基酸,预测成熟蛋白分子量分别为11.377、14.51、16.388、51.19k Da,等电点分别为4.72、5.41、7.46、5.08,Focc CSP2和Focc OBP1的N-端分别含有19、22个氨基酸组成的信号肽。获得Focc OBP2的c DNA序列880bp,通过生物学分析发现具有完整的开放阅读框,ORF长591bp,编码196个氨基酸,预测该成熟蛋白分子量为23.66k Da,等电点为7.41。3.西花蓟马嗅觉相关蛋白基因表达谱分析各基因在西花蓟马不同发育期的表达丰度差异较大,Focc CSP1在羽化1 d雌虫中的相对表达量最高,其次为2龄若虫;Focc CSP2在1龄若虫中的相对表达量最高,其次为羽化1天的雌虫;Focc OBP1在2龄若虫和1龄若虫中的相对表达量最高,其次为羽化1天的雌、雄成虫;Focc OBP2在2龄若虫中的相对表达量最高,其次为羽化1天的雌、雄成虫;Focc OR1在羽化1 d雌虫中的相对表达量最高,其次为2龄若虫、羽化1 d的雄虫。各基因均在触角中的表达量最高,Focc CSP1、Focc CSP2和Focc OR1均在触角中的相对表达量最高,其次为足;Focc OBP1基本上是在触角中特异性表达,在足、头、胸等部位该基因表达甚微;Focc OBP2在触角中表达量最高,在足部该基因也有少量表达。4.西花蓟马嗅觉相关蛋白的原核表达与纯化成功构建了重组表达质粒p ET-30a(+)/Focc CSP1、p ET-30a(+)/CSP2、p ET-30a(+)/OR1,经诱导表达及Ni柱纯化,成功获得不带融合标签的目的蛋白Focc CSP1和Focc CSP2,分子量分别约为11 k Da和15 k Da,采用BCA蛋白浓度测定法测定了纯化后目的蛋白的浓度,Focc CSP1蛋白浓度为1.455 mg/m L,Focc CSP2蛋白浓度为1.013 mg/m L,满足后续试验的需要。5.西花蓟马化学感受蛋白Focc CSP2结合特性选用19种化学气味分子作为配基测试了西花蓟马化学感受蛋白Focc CSP2的与各气味分子的结合能力,以1-NPN作为荧光报告子,结合能力最强的是茴香醛,[IC50]值为11.3944μmol/L,与Focc CSP2的竞争结合常数KD为10.5047;其次为香叶醇,[IC50]值为15.3463μmol/L,KD为14.1480。相对结合能力中等有甲基水杨酸、烟酸乙酯、异烟酸甲酯、苯甲醛、乙基苯、香茅醇、香茅醛、正壬醛、芳樟醇,[IC50]从35.2426μmol/L逐渐上升到85.6408μmol/L,KD也从32.4906增加到78.9534。其余气味物质的相对结合能力较弱。6.西花蓟马化学感受蛋白Focc CSP1免疫电镜定位通过免疫新西兰大白兔制备了Focc CSP1蛋白抗体,透射电镜观察显示,该蛋白抗体具有较强的免疫特异性,能与该蛋白很好的结合,并确切的反应出该蛋白的分布。胶体金颗粒在西花蓟马触角、感器、头、足等部位淋巴液中都明显标记,可见该蛋白基因组织分布广泛,与该基因基于q RT-PCR表达谱检测结果吻合。推测该基因除了参与环境气味物质的识别、运输外,还可能参与感受机械刺激、调节生长发育或其它重要的生理功能。