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【目的】1.分析我院产ESBL肺炎克雷伯菌临床常用抗生素及eravacycline敏感性,分析分离株耐药基因、毒力基因及MLST分型分布特点。2.产ESBL肺炎克雷伯菌eravacycline敏感性与耐药基因、毒力基因及MLST分型间的关系。【方法】1.菌株收集、复活与鉴定:收集深圳市第六人民医院2016年1月至2017年9月微生物实验室保存的122株肺炎克雷伯菌,用Phoenix TM100全自动细菌鉴定/药敏分析仪鉴定。以大肠杆菌质控菌株ATCC25922为质控株。2.产ESBL判定及常规药敏试验:根据CLSI标准,通过Phoenix TM100全自动细菌鉴定/药敏分析仪测定产ESBL分离株,并测定所有分离株对临床常用抗生素(如四环素、左氧氟沙星、头孢吡肟、复方新诺明、哌拉西林/他唑巴坦、庆大霉素)的耐药率。采用琼脂稀释法测定肺炎克雷伯菌eravacycline、亚胺培南、美罗培南最小抑菌浓度(MIC,minimum inhibitory concentration)值。3.聚合酶链式反应(PCR,Polymerase Chain Reaction)扩增毒力基因和耐药基因:采用PCR技术扩增荚膜抗原分型基因K1、K2、K5、K20、K54、K57及毒力基因Rmpa、R mpa2、Wcag、Aero等,PCR产物常规琼脂糖电泳判断毒力基因携带情况。PCR扩增产ES BL耐药相关基因SHV、OXA、TEM、CTX等,纯化SHV、OXA、TEM等耐药基因并测序(华大基因科技有限公司完成);耐药基因测序结果在https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi网站上比对。4.肺炎克雷伯菌MLST分型:扩增7组管家基因(gapa、mdh、pgi、phoe、infb、ton b、rpob)。管家基因PCR扩增产物纯化并测序(华大基因科技有限公司完成),测序结果应用DNAMAN.full.version.V5.2.2软件参照比对,并通过MLST官网http://www.mlst.net/公布的肺炎克雷伯菌MLST各等位基因的标准序列及型别进行分型。5.分析产ESBL肺炎克雷伯菌耐药基因、毒力基因、MLST分型分布特点:分析122株产ESBL肺炎克雷伯菌耐药基因SHV、TEM、CTX、OXA的阳性率;分析产ESBL肺炎克雷伯菌荚膜血清型K1、K2、K5、K20、K54、K57与Rmpa、Rmpa2、Wcag、Aero的阳性率及分布特点;根据管家基因扩增产物测序比对出MLST分型,以及各ST型别的分布特点。6.eravacycline敏感性与耐药基因、毒力基因及MLST分型间的关系:将eravacycli ne分成不同MIC值梯度,包括≤0.5μg/ml,1μg/ml,2μg/ml,4μg/ml,8μg/ml共5个梯度,分析不同耐药基因在各eravacycline的MIC值梯度中的分布特点;分析不同毒力基因在各eravacycline的MIC值梯度中的分布特点;分析eravacycline浓度≥4μg/ml时,毒力基因的检出率。【结果】1.产ESBL肺炎克雷伯菌标本来源及药敏检测结果:我院收集的122株产ESBL肺炎克雷伯菌最常见的样本来源是痰(72株,59.0%),其次是尿液、支气管分泌物及血液,分别有16株(13.1%)、11株(9.0%)、10株(8.2%)。产ESBL肺炎克雷伯菌对于四环素、左氧氟沙星、头孢吡肟、复方新诺明、庆大霉素等的耐药率分别为88.5%、40.1%、86.0%、99.2%、83.6%、58.1%;对于哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、eravacycline的耐药率分别为29.5%、0.8%、12.2%;未发现美罗培南耐药菌株。2.耐药基因、毒力基因和MLST结果:122株产ESBL肺炎克雷伯菌SHV、TEM、CTX、OX A等耐药基因的检出率分别为99.2%(121/122),54.9%(67/122),91.8%(112/122),11.5%(14/122)。肺炎克雷伯菌荚膜血清分型基因K1、K2、K20、K54、K57的检出率分别为20.5%(25/122)、5.7%(7/122)、1.6%(2/122)、3.2%(4/122)、2.5%(3/122);毒力基因Rmpa、Rmpa2、Wcag、Aero的检出率分别为18.0%(22/122)、14.8%(18/122)、18.0%(22/122)、21.3%(26/122)。根据管家基因测序比对结果,肺炎克雷伯菌共分成44个MLST型别,以ST11、ST23、ST133、ST35、ST15为主,分离率分别为5.7%(7/122)、5.7%(7/122)、9.8%(12/112)、5.7%(7/122)、4.1%(5/122)。3.eravacycline敏感性与耐药基因及毒力基因关系分析:以eravacycline MIC≤2μg/ml为敏感,eravacycline≥4μg/ml为不敏感(包括中介和耐药)为折点,eravacyc line不敏感率整体为31.9%。SHV、TEM、CTX、OXA等耐药基因存在eravacycline≥4μg/ml和≤2μg/ml中的阳性率分别为62.8%/37.2%、67.2%/32.8%、67.9%/32.1%、50%/50%;荚膜血清型基因K1、K2、K20、K54、K57在eravacycline≥4μg/ml的菌株中检出率分别为30.1%(12/39)、10.3%(4/39)、2.6%(1/39)、2.6%(1/39)、2.6%(1/39);毒力基因Rmpa、Rmpa2、Wcag、Aero在eravacycline≥4μg/ml的菌株中检出率分别为28.2%(11/39)、20.5%(8/39)、20.5%(8/39)、28.2%(11/39)。4.eravacycline敏感性与STs关系分析:本研究中收集的产ESBL肺炎克雷伯菌的ML ST分型主要为ST11、ST15、ST23、ST35、ST133等,检出率分别为5.7%(7/122)、4.1(5/122)、5.7%(7/122)、5.7%(7/122)、9.8%(12/122);这些ST11、ST15、S T23、ST133菌株中,eravacycline≥4μg/ml的菌株的检出率分别为71.4%(5/7)、20.0%(1/5)、42.8%(3/7)、41.7%(5/12);ST35型菌株对于eravacycline全敏感。ST23型产ESBL肺炎克雷伯菌中K1、Rmpa、Rmpa2、Wcag、Aero等毒力基因100%阳性。【结论】1.本院临床分离产ESBL肺炎克雷伯菌对eravacycline高度敏感,但仍有12.3%的菌株对其耐药,其耐药形式需扩大样本量进一步研究。本单位分离的产ESBL肺炎克雷伯菌最常见的耐药基因为SHV、CTX;最常见的荚膜血清分型为K1、K2型;主要的MLST型别为ST11、ST133。2.携带耐药基因的产ESBL肺炎克雷伯菌存在较高的eravacycline MIC值;且产ESBL肺炎克雷伯菌以K1和K2等高毒力血清荚膜型多见;在eravacycline不敏感产ESBL肺炎克雷伯菌分离株中,K1、Rmpa、Rmpa2、Wcag、Aero等毒力基因分离率仍然很高,多耐药高毒力菌株的存在是本地区产ESBL肺克的重要特点。3.在我院产ESBL肺炎克雷伯菌的MLST分型以ST11、ST23、ST133、ST15、ST35为流行型别;ST11、ST23、ST133型菌株对eravacycline的不敏感率均在40%以上,ST11更是达到71.4%,提示ST11型菌株可能具有eravacycline耐药克隆聚集性;且ST23型菌株可能为高毒力高耐药型菌株。