背景冠心病（Coronary heart disease，CHD）是临床最常见的心脏疾病之一，严重的可导致心功能衰竭，是一类严重危害人民健康的疾病，在我国心衰患者最重要的一个致病因素就是急性心肌梗死。其主要的病理生理过程为：冠状动脉狭窄，粥样斑块形成，心肌细胞缺血缺氧，变性坏死。由于成年心肌细胞缺乏再生修复能力，一旦坏死，细胞的绝对数量将减少，梗塞区心肌细胞将转化为疤痕组织而失去功能，致使心功能难以恢复，最终导致死亡，这种不可逆转的过程是治疗中最棘手的问题。心肌细胞再生代替受损的心肌是一种前景非常好的治疗方法，保护（增加）具有收缩功能的有效心肌细胞是治疗各种心肌损伤最为合理的途径，近年来，干细胞移植为心肌梗死的治疗提供了一种新思路，受到了广泛关注。目前，骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）的分离、纯化、鉴定及其多能诱导分化的研究已受到广泛关注。MSCs不仅可以分化为同胚层的成体细胞，而且在特定情况下尚可跨胚层分化，因此，被认为是最有希望的工程细胞之一。MSCs治疗心肌梗塞目前有少数报道，多数人认为，5～10天为移植较佳的时间点。但是，首先，这时的患者正处于疾病的危险期，进行移植手术存在很大的风险；其次，从细胞来源上，这个时间点内只能考虑库存的异体MSCs移植，而从临床应用角度来说，自体的干细胞优于胚胎干细胞及同种异体干细胞。心肌梗塞患者在入院后，必须经过一周左右的治疗，病情才比较稳定，能够耐受骨髓的抽取，一个月左右基本上能度过危险期，而在这段时间内，也能从技术上完成MSCs分离、培养或诱导分化，并获取足够数量、纯度及生长力的自体MSCs用于移植。所以我们研究的重点，是探讨自体移植的MSCs在发病一个月后的梗死的心肌中存活和分化为心肌样细胞的情况。具体实验设计如下：以新西兰大白兔为对象，研究MSCs自体移植治疗心肌梗死的前景，包括以下两个方面的内容：一、MSCs的体外培养、诱导和分化；二、诱导及非诱导的MSCs自体移植对心肌梗死后新西兰大白兔心功能的影响。第一部分兔骨髓间充质干细胞体外定向分化的实验研究目的对MSCs进行体外培养，了解其生长、增殖特性，以及5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza）诱导MSCs的最适诱导浓度。方法取新西兰大白兔胫骨骨髓，反复吹打混匀后制成骨髓细胞单细胞悬液。利用Ficoll淋巴细胞分离液(1.077g·ml^-1)进行梯度密度离心，分离获取MSCs，经含10％标准胎牛血清的DMEM培养基培养并差异贴壁纯化后传代。流式细胞仪检测生长良好的第二代培养细胞的表面标记CD29、CD34、CD45，鉴定我们培养的细胞是否为MSCs。调整细胞密度为1×10⁶个／ml，将细胞分为6组。按照5-aza诱导分化剂量分5个组，培养基中分别加入3、6、10、20、30(μmol·ml^-1)5-aza，与细胞共孵育24h，然后更换成DMEM完全培养基继续生长10天并获取细胞，通过倒置显微镜、透射电镜及免疫细胞化学等方法，了解细胞内结构的变化。另外一组为正常对照组。结果接种的MSCs 24h后开始出现贴壁细胞；48h后细胞出现突起，并转变成多角形、梭形；72h左右贴壁铺伸细胞数明显增加，突起变长，体积增大，细胞表现为纺锤形、梭形、多角形，并呈集落形分布，彼此不相接触；第4d开始，形成均匀分布的簇状增生灶，细胞呈长梭形，紧密排列；第5d后，细胞迅速增殖，簇状增生灶的数量及面积不断扩大，细胞形态趋于一致，并开始出现一定的方向性；10d以后，90％以上细胞融合，形态均为梭形，紧密排列呈旋涡状生长。未贴壁的细胞经反复换液基本已被清除。传代后的MSCs呈均匀分布的平均生长，第三代以后开始呈比较均一的成纤维状，并达到了移植的要求。通过流式细胞仪对第二代培养细胞的表面标记物CD29、CD34、CD45的检测，结果显示：CD29表达阳性（阳性细胞比率为87.6％），CD34表达阴性（阳性细胞比率为5.3％），CD45表达阴性（阳性细胞比率为2.4％），证实所分离培养的细胞为MSCs。不同浓度的5-aza诱导后的细胞，在倒置显微镜下可见细胞体积增大、形态延长，并形成肌管状结构，呈走行一致的束状排列；在透射电镜下可以观察到部分MSCs内有明显的肌丝形成，而且，在一定浓度范围内，细胞内肌丝的含量随着药物浓度增加而增加，其中10μmol／L^-1浓度的5-aza是能使大多数细胞向肌源性细胞分化的最小浓度；免疫细胞化学染色可见经诱导后的这些细胞能与抗肌红蛋白抗体发生反应，DAB显色，胞浆被染成棕红色，而未诱导的细胞未着色。结论：（1）通过梯度密度离心及差异贴壁相结合的方法，可以得到纯度较高的可供移植的MSCs。（2）MSCs可在体外经5-aza诱导后转化为肌源性细胞。（3）5-aza对MSCs的最适诱导浓度是10μmol·L^-1。第二部分兔骨髓间充质干细胞自体移植治疗缺血性心脏病的实验研究目的研究自体移植诱导及未诱导的MSCs对兔心肌梗死模型心功能的影响及差别。方法将实验动物随机分为5组：1、正常对照组（假手术组），2、心梗模型组，3、MSCs细胞（未诱导MSCs）移植组，4、肌源细胞（诱导后MSCs）移植组，5、培养基对照组。采取结扎左冠状动脉前降支的办法建立兔心肌梗塞模型。心梗模型建立一周后，取3、4、5组实验动物的胫骨骨髓，经梯度密度离心及差异贴壁纯化后得到MSCs并进行传代，传代至第二代时，将第4组给予10μmol·L^-1浓度的5-aza诱导24h，然后更换成DMEM完全培养基继续培养。MSCs在体外传代培养到第四代，于移植前24h，BrdU分别标记3、4组的MSCs，第二天分别将自体MSCs细胞悬液分4点注射到心肌梗死兔左室前壁，第5组注射等体积不含血清的DMEM培养液，第1组只开胸不注射。手术前后、细胞移植4周后，彩色多普勒超声心动图检测各组动物左室射血分数、左室侧壁运动幅度及左室收缩期室壁增厚率，血流动力学监测左心室最大压力上升速率（dp／dt），分别评价移植前后心肌梗塞模型兔的心功能，并进行统计学比较。所有检测指标完成后，取左心室组织切片，连续2张为一组：第一张5-溴尿嘧啶脱氧核苷（5-bromodeoxyuridine，BrdU）抗体免疫组化染色，第二张肌钙蛋白Ⅰ（TroponinⅠ，TnⅠ）抗体免疫组化染色。观察移植细胞的成活和分化状况。结果结扎冠状动脉前降支后，心电图检查可见V₁、V₃、V₅导联ST段明显抬高，证明建立的心梗模型是成功的。细胞移植4周后，经彩色多普勒超声心动图检测各组动物左室射血分数、左室侧壁运动幅度及左室收缩期室壁增厚率，经血流动力学监测左心室最大压力上升速率（dp／dt），所得结果显示：MSCs细胞移植组、肌源细胞移植组的心功能与心梗组、培养基对照组相比均有显著差异（P＜0.05）；与正常组（假手术组）相比仍有差异（P＜0.05）；MSCs细胞移植组与肌源细胞移植组相比无显著差异（P＞0.05），培养基对照组与心梗组相比无显著差异（P＞0.05）。超声心动图检测与血流动力学监测所得出的结果基本相似。梗死区注射经BrdU标记的诱导及未诱导MSCs后，免疫组化染色显示，心梗区内有部分细胞核呈棕褐色，在同一部位，TnⅠ单抗染色显示，这些细胞的胞浆呈棕褐色。结论（1）通过结扎前降支建立心肌梗塞模型的方法是确实、可靠的。（2）心梗区内植入自体经过诱导与未经过诱导的MSCs，都可以在心肌梗塞区成活并分化为心肌样细胞。（3）心梗区内移植自体经诱导和未经诱导的MSCs，均能改善实验动物心肌梗塞后的心功能。两组之间无统计学差异。