大豆是重要的作物,可以与根瘤菌形成共生固氮体系。推广根瘤菌菌剂的使用,有助于减少化肥使用量和环境污染。不同根瘤菌与同一大豆品种的共生能力是存在差异的。本研究的目的是揭示根瘤菌共生能力差异的遗传机制,为选育共生能力强的根瘤菌菌剂打下理论基础。Sinorhizobium fredii CCBAU 45436、Sinorhizobium sp. CCBAU 05631和Sinorhizobi m scojae CCBAU 05684属于不同的系统发育分支,不仅基因组大小不同(45436,6.91 Mb; 05631,6.26 Mb;05684, 6.09 Mb),而且与供试宿主植物(商业大豆品种冀豆17、野大豆和木豆)的共生能力存在差异:45436的共生能力最强,05631次之,05684的共生能力最差。本研究利用比较基因组方法分析了 3株菌的基因组差异,针对45436的15个基因簇构建删除突变体,发现反硝化基因簇的删除突变体与冀豆17、野大豆和木豆的共生能力显著下降;05631也具有反硝化基因簇,其删除突变体与野大豆和木豆的共生能力下降;而05684基因组中不包含这15个基因簇。在反硝化基因簇中,45436的nap(硝酸还原酶编码基因簇)突变体与宿主植物共生能力下降,nir(亚硝酸还原酶)和nor (一氧化氮还原酶)不是45436与宿主植物共生所必需的基因。05631与宿主植物共生所必需的基因不是nap、nir和nor,而是hemN1 (编码不依赖氧的粪卟啉原III氧化酶)。hemN基因在45436、05631和05684基因组中都有两个拷贝。hemN1的缺失导致45436和05631与野大豆形成能够固氮的红色根瘤,但植株表现出缺氮症状——这种缺氮症状是由于根瘤内植物的谷氨酰胺合成酶活性降低造成的,根瘤中该酶蛋白浓度降低,硝化水平显著上升。05684的hemN1和hemN2突变体与野大豆形成不能固氮的白色根瘤以及假根瘤,根瘤没有固氮酶活性。45436和05631的hemN1基因的功能可以相互替代,05631和05684的hemN1基因的功能也可以相互替代,但是,45436的hemN1不能回补05684的hemN1突变体的共生表型,而05684的hemN1可以回补45436的hemN1突变体的共生表型。hemN1和hemN2的功能发生分化,herrN2基因不能回补hemN1突变体的共生表型。nap和hemN1在45436、05631和05684与宿主植物的共生作用中的贡献具有系统发育分支特异性。05631和05684与冀豆17是不匹配的,这两株根瘤菌与冀豆17只能形成假根瘤。为了找到它们与冀豆17不匹配的决定因素,本研究通过构建Tn5随机插入突变体库和实验进化的方法,筛选到34株与冀豆17形成固氮根瘤的05631突变体,但没有筛选到与冀豆17匹配的05684突变体。34株05631突变体中有27株Tn5突变体和7株自发突变体,Tn5突变体的突变基因有三型分泌系统基因、ABC转运子基因等。经反向遗传学研究,只有三型分泌系统相关基因rhcC2和ttsI的pV0155插入突变体可以与冀豆17形成红色的固氮根瘤。选择15株Tn5突变体和自发突变体进行基因组重测序,证明由IS转座引起的三型分泌系统基因的突变是05631进化为冀豆17的匹配菌株的遗传基础。而15株Tn5突变体和自发突变体仍然与野大豆保持稳定的共生关系,共生表型与野生型相似,说明三型分泌系统基因的突变使得05631扩大了宿主范围。而本课题组同期开展的研究表明05684的三型分泌系统基因经反向遗传学突变后也可以和冀豆17建立有效的共生固氮体系,05684在与05631同样的实验条件下未能实现匹配性的进化可能与该菌株较低的进化潜力有关。