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慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)急变期的治疗一直是困扰临床的难题,寻找新的靶向基因可以为CML治疗提供新的策略。增强子结合蛋白α(enhancer binding proteinα,C/EBPα)在白血病的发生和分化增殖中具有重要的作用。已有研究表明在急性粒细胞白血病中, C/EBPα可调节包括节律基因Per2在内的下游靶基因的表达,而在CML的研究中,C/EBPα的许多功能及其对下游靶基因的调控许多未明之处。但C/EBPα和Per2在CML中的低表达以及两者之间调节作用的研究为我们探索CML急变提供了新的思路。因此,以C/EBPα的下游靶基因Per2为研究对象,进一步阐明二者在CML发病中的作用具有重要意义。目的:1探讨外源性C/EBPα对白血病K562细胞表型的影响及其与相关基因的关系,重点关注是否通过调控节律基因Per2进而发挥其在白血病中作用,为将Per2作为研究CML急变新的信号转导分子提供实验依据。2通过体内外实验,分别研究Per2对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖、凋亡和分化作用和对K562致瘤裸鼠皮下瘤和白血病模型鼠肿瘤生长的影响,为深入阐明Per2在CML发病机制和治疗作用提供新的思路。方法:1外源性C/EBPα对K562细胞表型影响及其下游相关基因的变化(1)将C/EBPα表达质粒pEGFP-C/EBPα及空载对照质粒pEGFP分别经阳离子脂质体介导转染K562细胞,用G418筛选出C/EBPα稳定表达细胞株。瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态学变化,流式细胞仪分析细胞表面分化抗原CD11b和细胞周期及凋亡,电镜观察细胞凋亡,RT-PCR及Western blot方法检测下游Per2、CyclinB1和C-myc基因的表达。(2)设计针对Per2基因的特异性及非特异性siRNA序列,构建siRNA-Per2质粒并转入K562/C/EBPα稳定表达细胞株,收集带红色荧光标记的siRNA-Per2-K562/C/EBPα细胞株进行实验。检测Per2干扰前后的基因表达水平变化。2 Per2基因对K562细胞增殖及凋亡的影响及其抗白血病机制将Per2表达质粒pcDNA3.1-Per2及空载对照质粒pcDNA3.1分别经阳离子脂质体介导转染K562细胞,用G418筛选出Per2稳定表达细胞株。瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态,台盼蓝拒染法和MTT法检测K562细胞增殖,流式细胞仪分析细胞周期和凋亡,电镜观察细胞凋亡,RT-PCR及Western blot方法检测P53、CyclinB1和C-myc的表达。3 Per2基因对白血病模型鼠致瘤能力和肿瘤生长影响的体内研究以Balb/c裸鼠为研究对象,分别经皮下注射和尾静脉注射转染组细胞株(K562/Per2)及空载组细胞(pcDNA3.1-K562)和对照组细胞(K562),建立裸鼠皮下瘤模型和白血病模型,观察Per2基因对两种模型小鼠致瘤能力和肿瘤生长、生理变化以及骨髓、肝脾等脏器变化和小鼠的生存期。结果:1筛选到稳定表达C/EBPα的K562/C/EBPα细胞株,与空载体转染组(K562/empty)及未处理对照组(K562/untreated)细胞相比,C/EBPα过表达能够促进K562细胞的分化,上调粒系细胞表面分化抗原CD11b表达;细胞周期G2期细胞增多[K562/C/EBPα组(17.18±3.5)%, K562/empty组(10.86±2.9 )%,对照组( 9.59±2.3 )%, P<0.05],同时出现凋亡峰,凋亡细胞明显增加,[K562/C/EBPα组21.1%, K562/empty组6.0%,对照组4.2%, P<0.05],电镜可见染色质浓集、断裂,核固缩和凋亡小体。Per2基因的mRNA和蛋白表达增高,而CyclinB1、C-myc基因mRNA和蛋白表达降低。siRNA-Per2成功转入K562/C/EBPα稳定表达细胞株,转染效率达到30%以上。特异性干扰Per2基因后,C/EBPα的下游基因CyclinB1、C-myc基因mRNA和及其蛋白的表达明显上调,而P53基因表达下调。2筛选到稳定表达外源性Per2基因的K562/Per2细胞株,与空载体转染组(K562/empty)及未处理对照组(K562/untreated)细胞相比,K562/Per2细胞体积缩小,但是分化不明显;细胞生长与增殖受抑制;细胞周期G2期细胞增多[K562/Per2组(36.04±5.5)%, K562/empty组(12.28±2.7 )%,对照组( 9.71±2.1 )%, P<0.05],凋亡细胞明显增加;电镜结果显示染色质浓集、断裂,核固缩和凋亡小体;P53基因的mRNA和蛋白表达增加,而CyclinB1、C-myc基因mRNA和蛋白的表达下降。3成功构建了裸鼠皮下瘤模型和白血病模型。在裸鼠皮下瘤模型中,转染组的肿瘤体积及重量明显低于对照组及空载组,且凋亡细胞明显增加。在白血病模型鼠中,转染组小鼠的骨髓增生程度明显下降,肝脾白血病细胞浸润明显减少,白血病小鼠的生存期延长。结论:1 C/EBPα能促使K562细胞的粒系分化,阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡;在分子水平调节节律基因Per2的表达增高,并抑制CyclinB1、C-myc基因的表达。干扰Per2的表达,C/EBPα对下游基因的调节受到影响,推测可能存在C/EBPα→Per2→下游相关基因→细胞表型变化的信号转导通路。2外源性表达Per2可抑制K562细胞的生长和增殖,促使细胞周期阻滞并诱导其发生凋亡,但对分化无明显作用。其机制可能是通过对细胞周期相关基因如P53、CyclinB1、C-myc等的调控并阻止细胞周期进程来实现的。3在动物实验中,Per2抑制皮下瘤模型裸鼠肿瘤的生长并促使细胞凋亡;在白血病模型鼠中,Per2抑制骨髓中白血病细胞的增殖,减少肝脾白血病细胞浸润并延长白血病小鼠的生存期。进一步说明Per2是作为一肿瘤抑制因子而发挥作用。