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结核病(tuberculosis,TB)主要是经呼吸道吸入结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)和牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis,M.bovis)的气溶胶而引起的人畜共患传染病。M.bovis能够感染包括人和牛在内的多个宿主,并且能在牛和人之间广泛传播,从而严重危害着食品安全和公共卫生健康。全球大约三分之一的人感染了M.tb并长期处于潜伏性感染状态(Latent TB infection,LTBI)。然而LTBI患者缺乏典型的结核病临床病理特征,大约有5%~10%的LTBI患者中会发展成活动性结核病,一旦感染了人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)后LTBI患者结核病的发病率将提高21~34倍。目前,唯独被批准用于预防结核病的疫苗为卡介苗(Bacille Calmette-Gue’rin,BCG),其是人工体外培养M.bovis连续传代所得的减毒活疫苗。但卡介苗对成人肺结核患者免疫保护力约为60%,并且在免疫缺陷的接种人群中容易发展为散播性卡介苗(Disseminated BCG)。骨髓源细胞表达的触发受体(Triggering receptor expressed on myeloid cells,TREM),通过调控Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)诱导的信号而调节先天免疫反应,并因此在微调炎症反应过程中发挥着关键作用。TREM1在传染性急性炎症疾病中具有诊断前景,包括结核胸膜肺炎;并且在非传染性炎症疾病及癌症中有治疗前景,例如动脉粥样硬化。目前,全球结核病面临的挑战包括:对M.bovis感染人致病的传播机制缺乏认识,BCG对肺结核患者保护力低下的机制仍然并不清楚,而且对潜伏性结核患者缺乏有效诊断方法和治疗手段。因此本课题通过同位素标记相对与绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ)技术分析了两种强毒性分枝杆菌复合体(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)菌株,包括M.tb-H37Rv和M.bovis,以及疫苗菌株BCG感染的人巨噬细胞(Human monocytes,THP-1)的差异蛋白质组。探讨了强毒株M.bovis感染人细胞过程中,潜在的免疫应答和传播机制。并以减毒疫苗株BCG感染小鼠,解析宿主的免疫应答过程和宿主细胞杀伤BCG的机制。接着以TREM1基因缺失小鼠作为动物模型,探讨TREM1介导的BCG感染宿主后差异应答反应。进一步揭示了,BCG诱导宿主的免疫应答及肺外结核病发展的分子机制。并且利用温敏性噬菌体转染的方法,高效而快速的获取pho P、Rv1759c和Lpr G等相关基因的缺失株。在获取结核分枝杆菌基因缺失菌株的基础上,探索相关基因与细胞及小鼠互作过程中的差异反应。通过病原菌基因改造、免疫调节和药物调控三方面并从病原与宿主互作的过程开展研究,为结核病的防治提供新思路。主要研究内容如下:1.强弱毒株感染人巨噬细胞差异蛋白组学分析成功获得MTBC强弱毒株感染THP-1细胞的差异蛋白表达谱,特别是牛源强毒株M.bovis诱导人巨噬细胞蛋白质改变。共同鉴定了2032个蛋白质,其中61个具有显著性差异。利用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)进一步分析发现,强毒株诱导的差异蛋白最显著的是吞噬体成熟通路和TNF信号通路,所涉及差异蛋白包括IFIT1、IFIT3、CCL20和ICAM1。61个差异蛋白中31个参与囊泡运输,由强毒株诱导的五个共同的差异蛋白包括NCF1和ICAM1,彼此相互作用且涉及免疫相关的信号通路,如白细胞跨内皮细胞迁移通路。BCG与H37Rv诱导THP-1不同的吞噬体成熟通路。不同毒力的分枝杆菌菌株感染巨噬细胞后,都能诱导大量差异显著的炎性细胞因子上调表达,但M.bovis诱导细胞IL-4表达水平显著性下调。溶酶体适配器蛋白LAMTOR2可能是牛分枝杆菌胞内物质运输的潜在靶标。揭示由M.bovis感染独特地诱导的MTHFD2,VPS26A和TBC1D9B蛋白,为结核病由牛到人的宿主传播靶点和新的生物诊断标识物。2.PMN在宿主应答BCG感染过程中的功能探索C57BL/6小鼠经呼吸道滴鼻方式感染BCG后,经流式细胞分析发现宿主通过中性粒细胞(Neutrophils,PMN)杀伤BCG,并且发现组织脏器存在不同程度的病理损伤。随着感染时间的推移,小鼠肺部的BCG逐渐被清除,在感染28天肺部检测不到BCG。经不同的感染途径,TREM1-/-小鼠所产生的病理损伤程度不相同,宿主免疫应答过程也存在差别。经呼吸道滴鼻方式感染BCG相比于尾静脉注射感染方式,TREM1-/-小鼠能产生更严重水平的肺部损伤和体重下降,并且伴随着肺脏、脾脏质量增加,及在感染7天肺组织能够分离出BCG。不同的感染途径,免疫组化分析TREM1-/-小鼠脾脏和肺脏组织均能产生高水平的PMN,但是对病原菌在肺部的杀伤能力不同。经尾静脉注射BCG感染后50天,施用免疫抑制剂地塞米松药物处理2周,TREM1-/-小鼠存活时间延长。通过尾静脉注射人源强毒株H37Rv后,TREM1-/-小鼠能够产生差异显著的IL-1β与IL-12。综上说明,宿主通过PMN能够有效的杀伤BCG,但是缺乏TREM1后肺部杀伤能力减弱。TREM1与PMN可能是结核分枝杆菌感染过程中,衔接宿主天然免疫与适应性免疫应答的纽带。而TREM1抑制剂与地塞米松可能为未来临床肺外结核病患者治疗提供新的思路。3.H37RvΔpho PΔRv1759cΔLpr G基因缺失菌株的构建利用噬菌体转染通过同源重组,成功构建了H37RvΔpho PΔRv1759cΔLpr G及M.bovisΔpho PΔLpr G缺失菌株。通过菌落形态试验肉眼观察,H37RvΔpho P与H37RvΔpho PΔRv175cΔLpr G的嵴状蜿蜒程度与亲本菌株相比减弱,特别是H37RvΔpho P。接着进行了细胞与小鼠感染,H37RvΔpho PΔRv175cΔLpr G缺失对菌株入侵巨噬细胞的能力显著性降低,且能诱导细胞显著性上调IL-1β。小鼠经尾静脉注射后,相比于亲本菌株:H37RvΔRv1759c与H37RvΔpho PΔRv175c对小鼠的致病力均有所减弱;感染小鼠血清细胞因子检测,缺失菌株H37RvΔRv1759c、H37RvΔpho P、H37RvΔpho PΔRv175都能够引起小鼠产生显著的TNF-α和IL-1β应答反应。本研究有助于进一步了解结核分枝杆菌自身基因改造与宿主免疫应答的互作关系。