中华鲟卵黄蓄积关键基因克隆及对饲料脂肪水平的响应研究

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ruqianwusan3
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中华鲟(Acipenser sinensis)是我国特有的大型生殖洄游性鱼类,数量稀少。为更好的保护这一珍稀资源,中华鲟的人工繁殖工作很早就已经开展。但由于养殖过程中大多数中华鲟雌性个体始终无法突破生殖障碍由II期顺利过渡到III期,这给人工增殖工作带来很大的困难。因此,研究其卵巢发育的分子机制以及影响其卵巢发育的关键营养因子至关重要。本文系统地克隆了中华鲟卵黄沉积及水解关键基因的c DNA全序列,对其分子特征及功能进行了详细的分析。最后通过投喂中华鲟不同脂肪水平的饲料,根据卵巢的发育状况以及卵黄沉积及水解相关基因的表达情况来研究饲料中不同水平的脂肪对其卵巢发育的影响。研究结果如下:1.关于中华鲟卵黄沉积及水解关键基因的分子鉴定及表达分析本文首次较系统地克隆得到了6个中华鲟卵黄沉积及水解关键基因(vtgr,atp6v1c1,atp6v1h,ctsb,ctsd和ctsl)的c DNA全长序列,对其c DNA及氨基酸序列进行生物信息学分析发现,我们克隆得到的6条基因(vtgr,atp6v1c1,atp6v1h,ctsb,ctsd和ctsl)的序列全长分别是3640 bp,1638 bp,1751 bp,1317 bp,1483bp和1438 bp,包括的开放阅读框分别是2568 bp,1152 bp,1434 bp,1020 bp,1191 bp和1020 bp,分别编码855,383,477,339,396和339个氨基酸。与其他脊椎动物氨基酸序列比对结果显示:相似性分别为76.4-85.7%,93.2-97.1%,93-97.7%,75.9-83.2%,66.4-92.7%和71.5-87.9%,同源性分别为70.4-81.5%,88-93.5%,89.2-94.8%,68.5-78.2%,58.9-86.1%和63.2-80.5%。结构域分析显示:中华鲟VTGR的氨基酸序列含有8个半胱氨酸富集的配体结合域(LBD),5个低密度脂蛋白受体YWTD结构域,3个类表皮生长因子结构域(EGF),1个跨膜结构域(TM)以及1个胞内域(CD)。中华鲟ATP6V1C1的氨基酸序列包括了7个酪蛋白激酶II磷酸化位点、5个N-肉豆蔻酰化位点、4个蛋白激酶C磷酸化位点、2个酪氨酸激酶磷酸化位点、2个O-糖基化位点、1个酰胺化位点和1个膜螺旋。中华鲟ATP6V1H氨基酸序列包含5个重复结构和27个α螺旋结构。中华鲟CTSB氨基酸序列包含3个半胱氨酸蛋白酶的保守活性位点(C108,H278,N298),1个氧阴离子穴(Q102),1个保守的N-糖基化位点,1个GCNGG保守序列和1个闭塞环。中华鲟CTSD氨基酸序列包含1个前体域、1个天冬氨酸蛋白酶结构域、2个活性位点、2个保守的N-糖基化位点。中华鲟CTSL氨基酸序列包含1个保守ERWNIN结构域、4个催化必须残基。时空表达的结果表明:这些基因在Ⅱ、Ⅲ期的卵巢中表达量相对比较高,在其他各组织中这些基因也均有差异性表达。氨基酸同源性分析、功能结构域分析以及系统进化树分析表明:中华鲟和雀鳝相关氨基酸序列的相似性以及同源性最高,亲缘关系最近。总而言之,这些基因在进化过程中是相对较为保守的,这为我们研究其生理功能以及分子机制奠定了基础。2.不同脂肪水平的饲料对中华鲟亲鱼卵巢发育的影响为研究饲料脂肪对中华鲟卵巢发育的影响,本研究分别用三种含不同脂肪水平(10%、14%、18%)的饲料进行性腺II期的中华鲟雌鱼培育。养殖一年后检测3组鱼的性腺发育推进程度以及卵黄沉积及水解相关的基因表达情况。结果表明:性腺分期的推进程度、卵巢厚度(d)以及卵巢区域比例(Po)都随着饲料中脂肪增加而增加,甚至在18%脂肪组中有2尾雌鱼卵巢直接进入III期。经卡方检验分析,性腺分期的推进程度与饲料中脂肪添加量显著相关。基因表达结果显示,饲料中脂肪显著上调了卵黄沉积及水解关键基因的表达水平。本研究初步解析中华鲟卵黄沉积及水解关键基因的分子特征及功能,为进一步探究中华鲟卵巢发育的分子机制奠定基础的同时也可以为研究亲鱼营养以及中华鲟的繁育与保护提供新的思路。
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