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目的:探讨RNF20缺陷对肝细胞肝癌的细胞增殖、侵袭、迁移和DNA损伤修复的影响及其相关的作用机制。方法:1.稳定低表达RNF20的SMMC-7721及Huh7肝癌细胞系的建立(1)针对RNF20基因设计3组短发夹RNA序列(RNF20-sh RNA1、RNF20-sh RNA2和RNF20-sh RNA3);(2)构建p Lent-U6-GFP-Puro-sh RNF20、p Lent-U6-GFP-Puro-sh Ctrl慢病毒载体;(3)包装慢病毒,感染人肝癌细胞SMMC-7721和Huh7,荧光显微镜观察其绿色荧光蛋白表达,经嘌呤霉素抗性筛选建立RNF20敲低的肝细胞肝癌稳转细胞系。(4)采用实时荧光定量PCR技术、免疫荧光染色法和免疫印迹法分别鉴定细胞中RNF20 m RNA以及RNF20蛋白的表达。2.RNF20缺陷对肝癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响及其机制(1)采用CCK-8、Brd U掺入实验、平板克隆实验、Transwell侵袭实验、划痕实验检测RNF20缺陷对肝癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响;(2)采用免疫印迹法检测RNF20缺陷对T-Akt及p-Akt蛋白的影响;(3)采用用转录组测序分析RNF20、Wee1、p27和p53基因的转录水平。3.RNF20缺陷对肝癌细胞DNA损伤修复的影响(1)慢病毒感染SMMC-771细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,免疫印迹法检测细胞中RNF20、H2B以及H2Bub1蛋白的表达;(2)采用电离辐射制造DNA双链断裂模型,采用免疫荧光染色法检测γH2AX、RPA32s33和Rad51蛋白的表达;(3)采用姐妹染色单体交换实验,分析细胞内姐妹染色单体交换、DNA断裂以及特殊结构的情况。结果:1.稳定低表达RNF20的SMMC-7721及Huh7肝癌细胞系的建立(1)荧光显微镜观察稳转细胞感染效率均高于85%;(2)实时荧光定量PCR结果显示,实验组肝癌细胞中RNF20 m RNA较对照组表达降低;(3)免疫荧光染色法和免疫印迹法结果显示,实验组肝癌细胞中RNF20蛋白较对照组表达降低;2.RNF20缺陷对肝癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响及其机制(1)CCK-8、Brd U掺入实验、平板克隆实验结果显示,RNF20缺陷的SMMC-7721和Huh7细胞较对照组细胞的增殖能力增强;(2)Transwell侵袭实验结果显示,RNF20缺陷的SMMC-7721和Huh7细胞较对照组细胞的侵袭能力增强;(3)划痕实验结果显示,RNF20缺陷的SMMC-7721和Huh7细胞较对照组细胞的迁移能力增强;(4)机制研究表明:RNF20的缺陷增强了SMMC-7721和Huh7细胞中的p-Akt蛋白的表达,且降低了细胞周期抑制基因Wee1、p27和抑癌基因p53的转录水平。进一步加入Akt抑制剂派立福新后发现,处理组肝癌细胞的增殖与迁移水平较未加药组降低,结果表明,抑制Akt通路导致RNF20缺陷的肝癌细胞增殖与迁移能力降低。以上结果提示,RNF20缺陷后通过Akt等通路促进肝癌细胞增殖和迁移。3.RNF20缺陷对肝癌细胞DNA损伤修复的影响(1)荧光显微镜以及免疫印迹法结果显示,RNF20缺陷以及表达H2BK120R的细胞较对照组细胞的H2Bub1降低;(2)免疫荧光染色法结果显示,RNF20缺陷与表达H2BK120R的SMMC-7721细胞较对照组细胞的γH2AX消失更加迟缓;(3)免疫荧光染色法结果显示,RNF20缺陷与表达H2BK120R的SMMC-7721细胞较对照组细胞的RPA32s33与Rad51蛋白表达降低;(4)姐妹染色单体交换实验结果显示,电离辐射后RNF20与表达H2BK120R的肝癌细胞中染色单体交换数明显降低且DNA断裂数较对照组升高。而且RNF20与H2Bub1缺陷的肝癌细胞内有比对照组数目更多的特殊结构,且电离辐射后缺陷组细胞内特殊结构的数目较对照组明显增多。结论:1.RNF20缺陷促进肝癌细胞增殖、侵袭与迁移;2.RNF20缺陷通过AKT等通路促进肝癌细胞增殖和迁移;3.RNF20缺陷导致肝癌细胞H2Bub1缺陷;4.RNF20缺陷导致肝癌细胞DNA双链断裂修复缺陷;5.RNF20缺陷导致肝癌细胞同源重组修复缺陷;6.RNF20缺陷导致肝癌细胞对电离辐射的敏感性增强。