论文部分内容阅读
胰高血糖素样肽-1(Glucagon like peptide-1,GLP-1)是一种治疗II型糖尿病的药物,针对其在体内半衰期短和在酵母中表达的批次间不稳定等问题,课题组前期对其进行改造,成功利用pMH3载体在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞中表达人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)融合蛋白NGGH(6×His-tag+Ek+2×GLP-1(A2G)+HSA)。这一设计研究不仅提高了GLP-1的体内半衰期,而且通过体外剪切解决了胞内N端剪切不齐的问题,从而提高了其成药性。为大规模制备融合蛋白,重组CHO细胞的高表达策略及培养工艺研究显得尤为重要。本课题将通过向培养基中添加一类小分子物质以提高蛋白表达量,并对其作用机理进行研究分析,而后对重组CHO细胞在5 L一次性生物反应器中培养条件进行优化。本研究分别对培养基中添加不同浓度苏拉明和丙戊酸后对重组CHO细胞生长和蛋白产量的影响分析,筛选出苏拉明和丙戊酸的最优添加浓度分别为50μM和0.75 mM。经对其作用机理研究发现,50μM苏拉明通过促进细胞生长和抑制细胞凋亡途径将蛋白产量提高了50%,0.75 mM丙戊酸通过抑制细胞周期和提高转录水平mRNA的量将蛋白产量提高了70%。将两者混合添加后发现,目的蛋白产量比不添加任何物质组提高了70%,苏拉明在一定程度可抑制丙戊酸对细胞的毒性,从而使得结束培养时细胞活率较高,减少培养液中杂蛋白含量,便于后期纯化。为实现大规模培养重组CHO细胞,本课题对其在5 L一次性生物反应器的培养工艺进行研究。分别对溶氧(dissolved oxygen,DO)控制、pH控制和补料方式进行优化。结果显示,在pH 6.8~7.4,溶氧(dissolved oxygen,DO)两相控制,全程补加F001补料培养基的条件下,分别在培养第一天和第三天添加苏拉明和丙戊酸后,细胞最大密度达到1.26×107 cells/mL,蛋白最终表达量可达283 mg/L,比摇瓶产量提高了35%。实现了重组CHO细胞从摇瓶到反应器高密度放大培养。培养液离心、过滤除菌后经亲和层析、疏水层析和离子层析分离,经牛重组肠激酶酶切后,过Ni柱去除His-tag,获得具备生物活性的融合蛋白GGH,其纯度达到96.1%,整个纯化过程总回收率达到22.1%。通过细胞模型CHO/GLP-1R-EGFP检测融合蛋白活性。结果显示,在上述条件下表达的融合蛋白与不添加任何物质在摇瓶表达的融合蛋白活性相当,即对重组CHO细胞培养工艺优化后并不影响其表达的融合蛋白的活性。