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真核延伸因子2激酶(eEF2K)是一种Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶,eEF2是其已知的唯一底物。eEF2K催化eEF2的Thr56位点发生磷酸化,导致降低eEF2与核糖体的结合能力进而抑制肽链延伸。通过近几年的研究发现,许多类型的癌细胞中均呈现eEF2K高表达或高度活化,尤其是在胶质瘤、乳腺癌中最为明显。eEF2K表达水平或者活性的改变还将影响细胞的许多生理进程,例如,细胞周期、细胞分化、细胞凋亡以及自噬等。其中eEF2K活性水平的改变与细胞自噬进程的调控又是其中的热点,在胶质瘤细胞系和乳腺癌细胞系中发现eEF2K活性增强能够诱导自噬,抑制eEF2K活性诱导的自噬能够增加多种药物的有效性。到目前为止对非小细胞肺癌细胞株中eEF2K的研究还基本处于空白阶段。吉非替尼为为EGFR酪氨酸激酶抑制剂的代表药物,也是临床上常用的治疗非小细胞肺癌的药物,但是随着作用时间的延长会逐渐出现耐药,限制了吉非替尼的应用。本课题目的：旨在观察在非小细胞肺癌中eEF2K是否与细胞自噬和死亡存在联系并研究eEF2K是否参与吉非替尼的耐药,为将来eEF2K作为抗肿瘤靶标提供更加充实的证据。第一部分非小细胞肺癌细胞株中吉非替尼诱导eEF2K活化与细胞自噬在本部分实验中采用吉非替尼处理非小细胞肺癌发现,吉非替尼能够显著增强非小细胞肺癌株H1975和A549中eEF2K的活性且具有一定的时间和剂量依赖性。通过免疫沉淀对自噬相关蛋白LC3和P62检测、免疫荧光检测自噬体颗粒状的形成以及通过透射电镜对自噬体形成的检测,发现吉非替尼能够导致非小细胞肺癌中自噬活性且具有时间和剂量依赖性。而且还发现由吉非替尼引起的eEF2K活性增加以及自噬活性增强在时间和浓度上存在一致性,表明两者可能存在某种联系。第二部分非小细胞肺癌细胞株中eEF2K与细胞自噬和死亡关系的研究1、抑制eEF2K舌性或干扰其表达后对由吉非替尼引发自噬的影响通过贫血清方法测定A484954在非小细胞肺癌中抑制eEF2K最适作用浓度100uM以及最适作用时间为6h,然后通过采用eEF2K小分子抑制剂以及加入其干扰片段抑制eEF2K的活性或者表达后,发现对由吉非替尼引起的自噬没有影响。并且通过对同样能够引起非小细胞肺癌株中eEF2K活性升高以及白噬活性增强的化合物Stattic试验,也得出同样的结论。2、吉非替尼引起的自噬和eEF2K活性对细胞生存的影响eEF2K的抑制并不能对由吉非替尼引起的自噬产生影响,接下来分别对由吉非替尼引起的eEF2K舌性升高、自噬活性增强及细胞生存能力情况三者进行探讨。发现在非小细胞肺癌株中通过3-MA抑制自噬的活性能够明显增强吉非替尼的药效,而通过A484954抑制eEF2K活性或者干扰其表达后在吉非替尼处于高浓度的情况下能够降低吉非替尼的药效,使得细胞生存能力增强且这种增强作用在提前将eEF2K舌性抑制后效果更为明显。3、eEF2K在非小细胞肺癌细胞株中的作用及作用机制初探在无吉非替尼作用下,通过A549细胞干扰eEF2K后细胞计数和平板克隆发现eEF2K被抑制以后能够导致细胞生存能力的增加,并能够引起自噬活性的增强。而在乳腺癌细胞中eEF2K被抑制可以减少自噬并抑制乳腺癌细胞生长。通过本研究我们初步明确了抑制eEF2K对吉非替尼引起的自噬无明显影响和导致细胞存活增加的原因可能是在非小细胞肺癌中eEF2K自身可抑制细胞自噬与细胞增殖。意义：通过本课题研究确定了在非小细胞肺癌细胞株中eEF2K不参与吉非替尼介导的耐药并且还发现在非小细胞肺癌细胞株中抑制eEF2K还能够导致细胞自噬活性增强以及生存能力提高,表明eEF2K在不同肿瘤细胞中的作用存在差异,这为将来有针对性地应用和开发有效的靶向eEF2K的药物奠定了基础。