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目的1．寻找啤酒中具有鉴别意义的特征性物质；2．建立啤酒特征性物质的HPLC-MS/MS的检测方法；3．建立啤酒特征性物质的固相萃取方法,并比较不同固相萃取柱以及液液萃取方法的回收率区别，并选择最优的方法；4．分别对各类发酵酒（包括啤酒、红酒和白酒）进行检测，确认所选特征性物质能用来鉴别各种酒类，为饮酒后导致的各类案件的检材采取、检测、结果分析及法医学鉴定提供科学依据；5．研究各种发酵酒饮用后，生物检材(包括唾液、尿液和血液)中通过对特征性物质的检测，推断是否饮用过啤酒。方法1．通过文献查新了解各种发酵酒中微量物质的差异以及啤酒特征性物质的初步确定；2．啤酒特征性物质的LC-MS/MS检测条件的优化：采用保留时间(Rt)和多反应监测(MRM)对特征性物质进行定性定量分析。选择2-3对离子定性，以1对响应值相对较高的特征离子的峰面积与其溶液浓度做标准曲线，用外标法进行定量。3．啤酒特征性物质的提取方法的优化：分别比较采取液液萃取和固相萃取方法方法的回收率，分析固相萃取柱包括Waters Sep-Pak C18和proElut C18 6cc (1000mg)。分别分析不同的PH条件下回收率，对洗涤溶剂和洗脱液做最优选择，建立固相萃取方法。4．人体饮用各种发酵酒后，通过对人体生物样本中啤酒的特征性物质的研究,甄别是否饮用啤酒的研究：5．人体试验的实验设计健康自愿者10人受试前三天禁酒，避免激烈的运动，保持良好的心态，将受试者随机分为三个实验小组：让自愿者饮酒前排尿作为空白对照，在1小时内匀速饮酒达最大耐受量，边饮酒边进食，食物荤素搭配适当。自开始饮酒后两个小时自静脉采血5~8mL，并收集唾液约3mL,在自愿者有尿意时收集中段尿，收集三次，并对收集时间做详细的记录，将采集的血液、尿液、唾液等人体生物样本放置于-20冰箱中保存，待检。第一组志愿者6人，饮用啤酒；第二组志愿者2人，饮用红酒；第三组志愿者2人，饮用白酒。6．生物样本的前处理及固相萃取a.检材的前处理：取出检材，解冻后高速离心，4000r/min的速度离心3分钟，取离心后的上清液3mL，加入50mM(PH约为3)甲酸铵缓冲液3mL，混匀备用；酒样超声除气40min加入甲酸调节PH，放置备用；b.活化和平衡：取ProElut C18 6cc (1000mg)柱，5mL甲醇活化，4mL水平衡，2mL甲酸铵缓冲液再活化，流速为3mL/min；c.上样：处理好的检材以1mL/min的流速过柱；d.洗涤：6mL水洗后50mM(PH约为3)3mL甲酸铵缓冲液洗涤，流速为2mL/min;e.吹干：用洗耳球吹干柱中残余的水分；f洗脱：B洗脱液进行洗脱，流速为1mL/min；g.收集：40℃下氮气吹2min，LC-MS/MS分析，采用保留时间很特征性离子对定性定量分析。7．统计学方法：实验数据结果以均数±标准差（(X|-)±S）表示，用SPSS11.5统计软件对检材中的异α-酸含量进行方差分析。结果1.黄腐酚经HPLC/MS/MS分析，结果表明在0.5～40.0μg/mL范围呈现良好的线性关系良好，相关系数R2为0.9929，最低检测限（LOD）为0.5μg/mL。2.异-α酸经液相分离，质谱分析，结果表明在0.1～31.163.0μg/mL范围内血液呈现良好的线性关系良好，相关系数R2分别为0.9945。异α-酸的标准溶液制成不同浓度，进行HPLC/MS/MS分析，检测结果显示最低检测限（LOD）为0.01μg/mL,信噪比（S/N）为4.5。结论1．据课本及文献报道：黄腐酚只存在于酒花中，所以啤酒黄腐酚的唯一来源，出于这个原因，考虑黄腐酚能用来区别啤酒和其它酒种。不同的啤酒中黄腐酚的含量不同，市售的大部分啤酒的黄腐酚含量小于0.1mg/L，国内外有相关的报道，检测到部分啤酒的黄腐酚的含量超过1mg/L，有的甚至高达2mg/L。2．经过固相萃取及高效液相色谱并联质谱对啤酒中黄腐酚的分析和检测，结果可知，与报道相符，在大部分啤酒中的黄腐酚含量在0.04~0.2mg/l，对于经过特殊加工了的啤酒会高一些。实验证明，啤酒中的这种物质如此甚微，用现有的条件不足以鉴别是否喝过啤酒。3．本文建立了生物检材中异α-酸的固相萃取方法和HPLC-MS/MS检测方法，灵敏度高，回收率高，重现性好，方法准确，操作简便，样品不需要衍生化处理，方法建立后适用于生物检材的快速检测。4．在啤酒中检测中异α-酸的含量，市售的啤酒中含量差别很大，从实验结果中可以看出：无醇啤酒中异α-酸的含量相对较低，而黑啤中的高了很多，这跟啤酒酿造过程中酒花添加量和工序有关。5．人体饮用啤酒后，异α-酸在人体内的分布个体差异性很大，唾液在开始喝酒的1.5小时后采集的第一次，浓度高于第二、三次。尿液是在喝酒后0.5小时后开始采集，第一次尿含量几乎没有，异α-酸在尿液中的分布是先上升后下降的趋势。血液采集时在开始喝酒后3.0小时，基本检测不到异α-酸，与唾液和尿液反映的情况是一致的。6．为了进一步搞清楚啤酒中异α-酸在人体的吸收、分布、排泄的状况，需要做大量的人体验证性实验，为甄别饮酒种类奠定坚实的基础。