PSD-007介导的光动力疗法治疗骨肉瘤的实验研究恶性骨与软组织肿瘤是严重威胁人类健康的疾患,骨肉瘤是其中最具代表性的肿瘤,发病率高,恶性度大,转移较早。关于骨与软组织肿瘤,目前治疗多采用手术治疗,辅以放化疗。然而,广泛手术切除常常累及周围正常的肌肉、血管和神经,造成术后功能障碍。保留正常周围组织可以带来更好的术后功能恢复,但局部复发的风险较高。辅助治疗可以降低局部复发的风险,同时也减少手术切除范围。但除经典骨肉瘤外其它间叶组织肿瘤大都对化疗不敏感,且有严重副作用。在其它骨与软组织肿瘤中,化疗和放疗的效果仍有争议。因此我们急需希望寻找一些新的辅助治疗手段。光动力疗法是一种独特的肿瘤治疗方法,它有别于上述传统方法,是通过在靶向组织中聚集的光敏化物质(光敏剂)产生的光氧化反应来杀伤组织,光敏剂通过静脉注射,选择性聚集在肿瘤细胞中。在氧存在的情况下,通过使用波长与光敏剂吸收峰相匹配的激光激发,光敏剂可以被集中激活,并把光子的能量转移到氧分子,通过直接杀死肿瘤细胞,破坏血供,以及炎性反应等多种途径破坏肿瘤。它的优势是可以保护周围正常组织的解剖和功能,使晚期肿瘤的微创手术切除和辅助治疗成为可能,是一种新的骨与软组织肿瘤辅助治疗手段。目的：探讨使用光敏剂PSD-007光动力治疗骨肉瘤的可能性,我们观察光敏剂PSD-007光动力疗法对体外培养的人骨肉瘤细胞系MG-63、小鼠骨肉瘤细胞系LM-8的光动力效应；观察PSD-007光动力疗法是否能导致体内肿瘤的坏死,并抑制肿瘤进展以及手术边缘切除联合光动力辅助疗法治疗C3H小鼠皮下荷LM-8肿瘤,是否能降低肿瘤局部复发率。方法：在体外实验中,通过MTT法测量在不同浓度PSD-007,不同剂量激光光动力治疗后两种细胞(LM-8,MG-63)的活力来评估光动力疗法的细胞杀伤效果。我们培养了人骨肉瘤细胞系MG-63、小鼠骨肉瘤细胞系LM-8,将MG-63细胞、LM-8细胞接种在96孔培养板(接种密度,2×103每微孔)培养,与不同浓度PSD-007(浓度依次为0、0.5、1、2、4、8μg/ml)孵育4小时,用培养基洗涤2次后,使用波长630nm不同剂量的激光照射(0、1.5、3、6、9 J/cm2),继续培养24小时。MTT法测量光密度(OD)值,检测细胞活力,我们每个浓度备5个复孔,经过处理的细胞MTT光密度值与未经处理的对照细胞进行比较,通过比色反映出细胞存活情况,并绘制细胞PDT后的抑制率曲线。光镜下观察PDT后细胞形态的变化,流式细胞技术检测细胞死亡机制。同样的方法种植3块96孔板,加药浓度分别为0、1、2、4、8、16μg/ml,对三块板都进行6J/cm2的光照射,照光完毕后更新培养基,分别培养15min、60min、90min后用MTT法测定各孔OD值,检测光动力治疗早期细胞的变化。所有实验均重复3次。在体内实验中,我们对4周龄雌性C3H小鼠用于皮下种植LM-8细胞。我们将LM-8单细胞悬液注射到小鼠腰骶部皮下(105个/只)。用游标卡尺测定肿瘤的生长。为了评估PSD-007在体内肿瘤的光动力疗效,当小鼠移植瘤直径为6-8毫米开始行光动力治疗。我们对C3H小鼠荷骨肉瘤LM-8模型静脉注射PSD-007(5、10 mg/kg),注射6小时后,用630nm激光照射(240 J/cm2),并选取HpD作为光动力疗效对照。(每组7只小鼠)。光动力治疗后,光照后避光饲养7天,以避免皮肤刺激。在激光照射后0、1、3、5、7天,测定肿瘤长度和宽度,然后用公式：[最长径(mm)]+[最短径(mm)]/2代表肿瘤的体积。光动力治疗后7天,吸入乙醚使小鼠安乐死,测量其大小并取材称取瘤重,并与未治疗的对照组进行比较。同时将移植肿瘤行组织学检测,将切除的肿瘤标本,固定包埋后切取4μm切片行苏木和伊红染色检验。此外,我们也研究了光动力作为减少肿瘤切除范围(即不包括周围的正常组织的边缘切除)及减少肿瘤局部复发的辅助治疗效果。当小鼠肿瘤直径达10-12毫米时,静脉注射PSD-007后,边缘切除肿瘤。我们将荷瘤小鼠模型分成三组(1)边缘切除无光动力治疗(对照组),仅切除肿瘤而周围的正常组织保留(2) PSD-007 5mg/kg,静脉注射6小时后行肿瘤边缘切除,剂量240J/cm2激光照射(3) PSD-007 5mg/kg,静脉注射6小时后行肿瘤边缘切除,剂量360J/cm2激光照射(每组n=10)。小鼠肿瘤边缘切除后观察4周。我们使用Fisher’s精确概率检验法比较单独边缘切除治疗组与手术联合光动力治疗组的肿瘤复发率。p<0.05可看作具有显著差异。结果：体外实验表明PSD-007光动力疗法对体外培养的MG-63细胞、LM-8细胞有明显的杀伤作用。体外的光动力效应取决于光敏剂PSD-007治疗浓度和激光的照射剂量。单独用激光照射以及单独注射PSD-007无激光照射均无抗肿瘤作用。相同PSD-007浓度下,激光照射的剂量越高,其抗肿瘤作用越强。通过直接杀伤及诱导凋亡两种模式最终导致细胞死亡。小鼠荷瘤LM-8模型的体内试验显示,PSD-007介导的光动力疗法可以抑制肿瘤的生长。单独注射PSD-007无激光照射或单纯照光均没有抑制肿瘤的生长。对荷瘤小鼠行肿瘤边缘切除联合局部光动力疗法可以降低肿瘤的局部复发率。10只没有联合PDT的小鼠,9个在边缘切除4周后在病灶切缘出现局部复发。在10只手术联合PDT治疗的低剂量激光组(240J/cm2)小鼠中,4个小鼠出现肿瘤局部复发。在高剂量激光组(360J/cm2)小鼠中,只有2只复发。而且,边缘切除术联合光动力治疗无伤口延迟愈合或皮肤缺损等副作用。边缘切除联合PDT高剂量激光组(5mg/kg,360J/cm2)的局部复发率显著低于单纯边缘切除。此外,肿瘤复发发生在光动力治疗周边部位。结论：PSD-007光动力疗法对骨肉瘤细胞LM-8、MG-63有明显的杀伤作用,体外光动力效果依赖PSD-007的浓度及照射激光的剂量。体内实验中,PSD-007介导的光动力疗法可以抑制肿瘤的生长,高剂量激光有较强的治疗效果。肿瘤边缘切除联合PSD-007介导的光动力疗法可以减少手术切缘和保护毗邻肿瘤的神经血管等关键解剖结构,降低肿瘤的局部复发率,在骨肉瘤的治疗中,具有巨大前景。