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肝纤维化中铁沉积是一个常见的病理现象,我们以前的研究证实了DMN导致的大鼠肝纤维化中有严重的铁沉积,且主要沉积于枯否细胞中。那麽,铁沉积于枯否细胞中导致枯否细胞有什麽改变?是否可能促进枯否细胞分泌促肝纤维化细胞因子?中药对这些促进肝纤维化的细胞因子表达有何影响?本研究试图揭示这些问题。1铁沉积于巨噬细胞的浓度探索用RAW264.7细胞系进行铁沉积实验,必须先探索适合的铁剂量,以找到铁对RAW264.7细胞系的无毒浓度,然后才能进行下一步实验。MTT实验显示了FAC在100uM以下时即对RAW264.7细胞已经没有破坏;RAW264.7细胞在100uMFAC作用24h后的铁染色实验,显示了在100uM浓度FAC作用24h后Raw264.7细胞质中出现了明显的铁沉积。2铁沉积于巨噬细胞后肝纤维化相关细胞因子表达变化将铁(柠檬酸铁胺)作用于RAW264.7细胞24h后收集细胞,用荧光定量PCR法检测转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGFβ1)、血小板源生长因子β(platelet-derived growth factor beta,PDGF-β)、诱生型NO合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)、基质金属蛋白酶13(Matrixmetalloproteases 13,MMP-13)mRNA表达量,结果显示,TGF-β1mRNA显著下调,PDGF-β、MMP-13mRNA无明显变化,iNOSmRNA、TNF-αmRNA均显著上调。3GdCL3、去铁胺对铁沉积于巨噬细胞表达肝纤维化相关细胞因子的影响GdCL3可以废除巨噬细胞功能,去铁胺可以减轻铁沉积,那麽这二者作用于铁沉积的RAW264.7细胞后对其分泌促肝纤维化细胞因子有何影响?实验结果显示,用GdCL3处理后,铁沉积的RAW264.7细胞表达TGF-β1mRNA在10mg/ml、2mg/ml、0.4mg/ml均显著上升;Inos1mRNA表达在10mg/ml、2mg/ml、0.4mg/ml、80ug/ml、16ug/ml浓度时均显著下降;TNF-αmRNA表达在10mg/ml、2mg/ml浓度时均明显降低;这些说明了GdCL3的确可是影响巨噬细胞的功能,GdCL3影响了iNOS及TNF-αmRNA的表达,这也为GdCL3逆转肝纤维化大鼠模型提供了实验支持。DFO处理铁沉积的RAW264.7细胞后,与GdCL3的结果类似,TGF-β1、Inos1、TNF-αmRNA也出现了类似变化,说明去铁疗法可能通过影响枯否细胞表达促炎及促纤维化因子而起到治疗肝纤维化作用。4中药复方对铁沉积于巨噬细胞表达肝纤维化相关细胞因子的影响前面的实验表明了铁沉积于巨噬细胞可改变一些肝纤维化及炎症相关细胞因子的表达,那麽,中药是否对这些细胞因子有正面的影响?中药是否通过影响这些细胞因子而达到治疗肝纤维化的效果?本实验试图利用RAW264.7细胞沉积铁之后,用中药作用于该细胞观察是否影响这些细胞因子的表达。实验结果显示,中药可以使铁沉积后降低的TGF-β1mRNA显著回升,使升高的iNOS1、TNF-αmRNA显著下降,这说明中药可能通过作用于这三种细胞因子的表达而使肝纤维化病理得到改善。5中药复方对DMN所致肝纤维化大鼠肝组织表达肝纤维化相关细胞因子的影响前面的实验显示了铁沉积可以影响部分肝纤维化相关细胞因子mRNA的表达,中药可以明显改善这些细胞因子mRNA的表达。那麽,中药在肝纤维化动物模型体内是否也有类似作用?本实验拟通过DMN致大鼠肝纤维化模型来揭示这一问题。实验结果显示,TGF-β1mRNA的表达与细胞中的表达截然相反,在模型组中是升高的,这说明了在动物体内的情况与巨噬细胞中是不同的;INOS和TNF-αmRNA的表达则在肝组织与体外巨噬细胞一样都是升高的,这二者都是重要的促炎症因子,而炎症的持续必然促进肝纤维化的进展,所以INOS1和TNF-α也可以称作促肝纤维化细胞因子。本实验用GdCL3腹腔注射于DMN所致的肝纤维化大鼠,结果显示肝纤维化模型肝组织病理改变比模型组明显减轻,这与以往研究结果相同。本实验中用中药复方灌胃于肝纤维化大鼠3周,结果显示中药复方不但明显改善了肝纤维化大鼠肝组织的病理改变,而且明显改善了与铁沉积相关的三个细胞因子mRNA的表达。