这一博士学位课题由相对独立的两部分研究工作构成。第一章 与Ⅰ期肺腺癌术后复发转移相关的microRNA背景:有30～35%的早期肺腺癌患者根治术后死于肿瘤复发和远处转移,筛选预测患者预后或肿瘤转移相关的肿瘤分子标志物,并采取以分子分型为基础的靶向药物治疗,将有可能在一定程度上延长肺癌患者的生存期。microRNA(miRNA)在肺癌的发生发展、侵袭转移等病理过程中发挥致癌基因或抑癌基因的功能,其表达情况也与患者的预后以及放化疗敏感性或抵抗性有关。本项研究的目的是筛选、发现并验证一组与Ⅰ期肺腺癌术后早期复发转移相关的miRNA,明确候选miRNA的生物学功能和调控的靶基因,并且评估候选miRNA及其靶基因的蛋白产物作为Ⅰ期肺腺癌预后的分子标志的效能。方法:募集160例Ⅰ期肺腺癌患者进入研究队列,包括“起始样本”80例和“独立样本”80例。将根治性手术切除后2年内发生复发转移的病例界定为早期复发转移(RM)组,“起始样本”40例,“独立样本”39例;5年以上未复发转移的病例界定为无复发转移(NRM)组,起始样本”40例,“独立样本”41例。收集入组病例的手术切除福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织,制备总RNA。利用基因芯片技术(miRNA表达谱芯片),获得“起始样本”RM组和NRM组患者的miRNA表达谱及其差异表达miRNA。通过生物信息学分析,筛选、发现一组与Ⅰ期肺腺癌术后早期复发转移相关的miRNA。并且,基于这一组差异表达miRNA,采用Cox 比例风险回归方法构建一个Ⅰ期肺腺癌预后评估模型;同时对“独立样本”的组织样品行Real-time PCR分析,验证差异表达miRNA,并测试Ⅰ期肺腺癌预后评估模型的效能。另外,通过双荧光素酶报告基因和体外细胞功能实验明确上述筛选出的miRNA所调控的靶基因和miRNA的生物学功能。进而最后利采用免疫组织化学方法分析肿瘤组织中miRNA靶基因的蛋白表达状态,及其临床意义。结果:按照置换检验(p<0.05和Fold Change>1.5)和生存分析(log-rank检验p<0.05)的标准,从“起始样本”中筛选出8个候选差异表达miRNA(miR-1260b、miR-21-3p、miR-4514、miR-4659a-3p、miR-2467-3p、miR-3621、miR-1471、miR-92a-3p)。其中miR-21-3p在“独立样本”RM组中的表达显著高于NRM组(p=0.02)。“独立样本”的RT-PCR数据验证了 Ⅰ期肺腺癌预后评估模型的效能,敏感度为74.4%,特异度为68.3%,准确度为71.3%,并且提示miR-1260b和miR-92a-3p为Ⅰ期肺腺癌患者无进展生存(PFS)的危险因素,而miR-2467-3p为保护因素。目前尚未见有关miR-2467-3p的生物学功能的研究报道。本项研究体外细胞增殖实验结果表明,miR-2467-3p过表达能够抑制肺腺癌细胞A549和H1975的增殖能力;细胞周期检测实验结果则提示,miR-2467-3p可能通过将A549和H1975细胞阻滞在G0/G1期而抑制细胞增殖;细胞侵袭实验结果表明,miR-2467-3p过表达显著抑制A549和H1975细胞的侵袭能力(p<0.001)。双荧光素酶报告基因实验结果提示,CHEK1是miR-2467-3p的靶基因之一;而免疫组织化学分析结果显示,在“起始样本”和“独立样本”中,RM组的胞浆内CHEK1的表达显著高于NRM组(p<0.05)。结论:miR-21-3p高表达与Ⅰ期肺腺癌术后复发转移有关;构建的Ⅰ期肺腺癌预后评估模型能较好地预测和评估Ⅰ期肺腺癌患者的预后;miR-2467-3p与肺腺癌复发转移有关,具有抑制肺腺癌的复发转移作用,是一种抑癌性miRNA,有可能作为潜在的肺腺癌临床治疗靶点;而CHEK1是miR-2467-3p的靶基因之一,有可能成为辅助评估Ⅰ期肺腺癌患者预后的分子标志物。第二章 与结直肠癌肝转移潜能相关的基因背景:远处转移占结直肠癌死亡人数的90%,转移引起的并发症是结直肠癌死亡的主要原因,肝脏是最常见的结直肠癌转移定植的器官。有研究提示结直肠癌肝转移灶内的某些基因改变与结直肠癌的定向肝转移密切相关,但目前,对于结直肠癌肿瘤细胞转移的组织倾向性的遗传学基础还不甚清楚。本项研究有针对性地比较和分析结直肠癌肝转移的原发瘤和转移瘤共同的基因组及转录组改变,发现原发瘤中具有肝转移潜能的肿瘤细胞亚群,寻找筛选与结直肠癌肝转移潜能相关的基因,为探讨结直肠癌的肝转移机制奠定基础。方法:入组6个结直肠癌肝转移病例,对一期手术切除的患者的原发灶和转移灶组织多点取样。采用第二代测序(Next Generation Sequencing,NGS)技术,针对入组病例的原发瘤和肝转移瘤的多点取样组织样品,分别进行全外显子组测序(以其自身外周血单个核细胞为对照),和转录组测序(以相应癌旁组织为对照),获得患者的基因突变图谱和基因表达谱。通过聚类分析、主成分分析和进化树分析,研究原发瘤内、原发瘤和转移瘤间的肿瘤异质性,探索转移瘤的可能来源。采用克隆进化分析、加权基因共表达网络分析以及基因突变与基因表达之间的关联性分析,获得结直肠癌肝转移过程中变异等位基因频率改变和基因突变引起的显著差异基因表达数量以及基因在基因共表达网络中的位置,筛选与结直肠癌肝转移潜能相关的基因。结果:全外显子组测序数据的聚类分析和进化树分析结果提示,从6例患者的7个原发瘤的19个组织样品中初步鉴定出具有肝转移潜能的肿瘤细胞亚群;例如:病例 C1 的 DC1-T3,病例 C2 的上原发灶(DC2-Tu1、DC2-Tu2、DC2-Tu3),病例C3 的 DC3-T1 和 DC3-T2,病例 C4 的 DC4-T1,病例 C5 的 DC5-T3,病例 C6 的DC6-T2和DC6-T3。针对转录组测序数据的加权基因共表达网络分析结果表明,原发瘤和转移瘤具有不同的基因共表达网络,相同的基因的在两组网络中的连接度也不同,提示该基因在原发瘤和转移瘤中具有不同的重要性。克隆进化分析结果显示,52个亚克隆在转移瘤中的平均变异等位基因频率比原发瘤中的高,提示在肝转移的过程中具有这些突变基因的细胞群体不断扩大,而这些突变基因可能与结直肠癌肝转移密切相关。基因突变与基因表达的关联性分析结果显示:虽然转移瘤中的突变基因个数只有原发瘤中的55.3%,但是其突变后引起的显著差异表达基因数量明显比原发瘤中的多;有些基因在原发瘤和转移瘤中突变引起的显著差异表达基因数量并不一致;提示相同的突变基因在原发瘤和转移瘤中具有不同的重要性,结直肠癌肝转移过程中某些基因逐渐占据重要位置。基于上述分析结果筛选得到37个基因;这些基因在原发瘤和转移瘤中都发生了突变,与原发瘤相比,变异等位基因频率和突变后导致的显著差异表达基因的数量在转移瘤中升高和增多,并且在转移瘤的基因共表达网络中的连接度大于2;它们被认为是与结直肠癌肝转移潜能相关的基因。针对它们的验证工作正在进行中。结论:本项研究从入组病例的结直肠癌原发瘤中鉴定出了具有肝转移潜能的肿瘤细胞亚群,由于其中携带转移潜能相关的突变基因,从而介导了肿瘤的转移;其中的分子机制尚需针对本项研究筛选得到37个与结直肠癌肝转移潜能相关的基因进行验证后,再进行深入研究。