骨损伤危害人们的健康和生活,骨组织工程的建立为骨损伤治疗带来了新的希望。但研究发现,组织工程骨对骨损伤(特别是极限骨缺损)的修复能力有限。究其原因,其一是种子细胞在体外的成骨分化能力有限,特别是羊膜来源的间充质干细胞(AMSCs),其体外成骨分化能力显著低于骨髓间充质干细胞,且成骨分化的调控及相关机制认识不足。其二是组织工程骨内部细胞活性差,易坏死。虽然以内皮细胞为基础的预血管化策略现已应用,但在预血管化组织工程骨的构建过程中,由于血管内皮细胞(ECs)与间充质干细胞(MSCs)相互作用及其分子机制仍不清楚,因此影响了构建物的成骨和成血管功能,进而影响体内骨损伤的修复效果。针对上述关键问题,本研究采用小分子化合物丁酸钠调控人羊膜来源间充质干细胞(hAMSCs)的成骨分化,进一步探究丁酸钠调控羊膜间充质干细胞成骨分化的作用机制。在血管内皮细胞与间充质干细胞直接混合共培养体系中,考察在2D静态培养和3D动态培养环境下血管内皮细胞对间充质干细胞成骨分化及间充质干细胞对血管内皮细胞血管样结构形成的影响,并探究两种细胞之间的相互作用机制。研究结果为体外调控共培养物的成骨分化、血管发生以及构建预血管化的组织工程骨提供数据支持和策略指导。首先,将丁酸钠(一种去乙酰化酶抑制剂)直接添加到生长培养基和成骨诱导培养基,考察丁酸钠的作用浓度和作用时间对hAMSCs增殖和成骨分化的影响。研究结果表明,低浓度的丁酸钠(≤1.0mM)通过将细胞周期阻断在G0/G1期影响hAMSCs增殖,而高浓度的丁酸钠(5.0mM)则诱导细胞发生凋亡。在丁酸钠低浓度(0.50mM)短时间(3 d)作用下,对hAMSCs成骨分化具有一定的促进作用;而丁酸钠高浓度(1.0 mM)长时间(14 d)作用下,对hAMSCs成骨分化产生一定的抑制作用。进一步研究发现,丁酸钠处于低浓度短时间处理,能够促进ERK信号分子的磷酸化,诱导H3K9超乙酰化(H3K9-Ace),降低组蛋白去乙酰化酶8(HDAC8)的表达水平,促进成骨分化基因ALP、Runx2、OPN 和OCN 的转录以及 Runx2、TAZ、Collagentypel、OPN 及 OCN 的表达,从而促进细胞的成骨分化;而丁酸钠处于高浓度长时间处理,则降低H3K9的乙酰化程度,提高HDAC8的表达量,导致上述成骨分化标志基因和蛋白的表达水平降低,从而抑制hAMSCs成骨分化。其次,通过建立2D细胞共培养模型,初步探究骨髓来源间充质干细胞(BMSCs)与血管内皮细胞(ECs)的相互作用机制。采用全骨髓贴壁法分离大鼠来源的骨髓间充质干细胞,经传代培养,检测细胞表面抗原、细胞生长及三向分化潜能,确定分离出的BMSCs具正常MSCs的功能。将BMSCs与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)以不同的接种比例直接混合共培养于4种培养基中,考察细胞比例、培养基对共培养物血管样网络结构形成和成骨分化的影响,确定适于共培养的细胞接种比例及培养基,即BMSCs与HUVECs以1:2共培养于OIM+1%ECGS中,建立了 BMSCs与HUVECs直接混合共培养体系。基于不同的2D共培养模型,考察直接接触和间接接触共培养对共培养物成骨分化和血管发生的影响,探究间隙连接、细胞因子及外泌小体在共培养体系中的作用。实验结果表明,在成骨诱导环境中,直接混合共培养对BMSCs的成骨分化具明显的促进作用,而在Transwell和条件培养基中间接共培养均不能促进BMSCs的成骨分化。由此可见,HUVECs对BMSCs成骨分化的促进依赖于两种细胞的直接接触,其中间隙连接蛋白Cx43在共培养初期共培养物中的表达量急剧上升,细胞因子和外泌小体均不是促进BMSCs成骨分化的主要因素。进一步研究发现,HUVECs对BMSCs成骨分化的促进作用涉及多种信号途径,包括BMP信号途径、Hedgehog信号途径及Wnt信号途径等。对共培养物血管发生影响的研究发现,在成骨诱导条件下,无论BMSCs与HUVECs是否直接接触,内皮细胞血管样网络结构的形成均受到严重阻碍。直接混合共培养后,内皮细胞中成血管相关基因的转录及关键受体蛋白的表达均显著降低。此外,BMSCs与HUVECs直接混合共培养对两种细胞表面抗原的表达无显著影响,可将HUVECs细胞表面抗原CD 31作为后续共培养物流式分选的标记。基于上述实验结果,进一步考察间隙连接及由间隙连接通道介导的穿梭分子在直接混合共培养体系中对共培养物成骨分化和血管样结构形成的影响,探究BMSCs与HUVECs相互作用的分子机制。采用免疫荧光染色和染料穿梭实验证实了 BMSCs与HUVECs能够形成由Cx43介导的间隙连接,且该通道具有物质传递的功能。通过采用间隙连接的抑制剂18GA和激活剂PTH,进一步证明了两种细胞间形成的间隙连接能够影响共培养物的成骨分化和血管样网络结构的形成,且发现了 Cxcl9和VEGF的表达水平与间隙连接蛋白Cx43具相关性。通过文献调研及生物信息学软件预测,发现miR-200b可能在共培养体系中发挥调控作用。在间隙连接激活剂PTH、抑制剂18GA和外泌小体抑制剂GW4869作用下检测BMSCs与HUVECs单独培养和共培养时两种细胞中miR-200b的表达,发现miR-200b可通过Cx43介导的间隙连接通道从BMSCs转移到HUVECs。细胞转染实验进一步证实了在BMSCs与HUVECs共培养时,因miR-200b从BMSCs转移到HUVECs,使BMSCs中miR-200b的含量降低,导致BMSCs中vegf-α的转录上调,VEGF-A的表达提高,进而促进BMSCs的成骨分化;而miR-200b进入HUVECs后,降低内皮细胞中成血管相关基因ZEB 2、ETS 1、KDR及GATA 2的转录,从而抑制内皮细胞形成血管样的网络结构。研究还发现,TGF-β是调控miR-200b转移的重要因子,在共培养体系中添加TGF-β的抑制剂SB431542或其中和性抗体,共培养物血管样网络结构的形成得以部分恢复。最后,将BMSCs与HUVECs同时接种在Cultispher S微载体上,并在转瓶培养体系中采取“生长-诱导”两段式培养,考察在3D动态培养环境中共培养物的成骨分化和血管发生,并比较3D动态培养与2D静态培养在关键基因转录水平的异同。研究表明,在3D动态培养环境中经成骨诱导后,共培养物的成骨分化能力显著强于BMSCs单独培养组,但共培养物血管样结构的形成明显受阻,这与2D静态培养的现象一致。通过qRT-PCR检测关键基因的表达发现,在3D动态培养体系中,共培养组中成骨分化标志基因的转录水平均显著高于BMSCs单独培养组,且cxcl9和vegfa呈现与cx43相同的变化趋势,与2D平板静态培养的基因表达结果基本一致,仅在表达差异最显著的时间点上略有不同。基于不同微组织的组合,初步尝试预血管化骨微组织的构建,在生长培养基中将BMSCs和HUVECs直接混合共培养1 d的微组织与成骨诱导14 d后形成的骨微组织以1:1组合,采用该策略制备的构建物可以实现成骨和成血管功能。综上所述,本研究探究了小分子化合物丁酸钠对人羊膜间充质干细胞成骨分化的影响,并在2D静态和3D动态培养环境下认识了骨髓来源间充质干细胞与血管内皮细胞之间的相互作用机制,为体外调控共培养物成骨和成血管功能以及构建预血管化的组织工程骨提供理论依据和策略指导。