论文部分内容阅读
目的:前列腺癌是全球男性常见的恶性肿瘤之一。由于人口老龄化、动物脂肪摄入量增加以及体育运动减少等诸多因素,前列腺癌发病率和死亡率逐年增加。以雄激素受体(AR)为核心的雄激素剥夺治疗长期使用会导致去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的发生。17β-羟甾脱氢酶Ⅲ(17β-HSD3)是前列腺癌治疗独立于雄激素受体的新靶点,本研究对实验室自主合成的姜黄素系列衍生物进行了 17β-HSD3为靶点的抑制剂筛选,以期找到新的前列腺癌治疗小分子药物。方法:(1)采用放射免疫分析法检测给药后稳定转染并表达17β-HSD3的LC540(17β-HSD3)细胞上清中睾酮和孕酮的含量来筛选对17β-HSD3敏感的姜黄素衍生物;(2)实时荧光定量PCR法(RT-qPCR)检测不同化合物不同浓度作用后,LC540(17β-HSD3)细胞中17β-HSD3基因的表达情况;(3)四甲基偶氮唑盐微量酶反应(MTT)比色法检测化合物对LNCap、PC3和LC540(17β-HSD3)细胞增殖的影响;(4)蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测LC540(17β-HSD3)细胞株中睾酮生物合成通路中五个关键酶:17β-HSD3、StAR、CYP11A1、CYP17以及3β-HSD的表达情况;(5)体外睾丸微粒体法检测目标化合物H10对17β-HSD3蛋白酶活性的影响;(6)SD大鼠连续七天给药,7天后取血检测体内激素含量;(7)构建LNcap荷瘤裸鼠模型,随机分成5组:生理盐水组(A);溶剂组(B);H10低(10mg/kg,C)、中(30mg/kg,D)、高(50mg/kg,E)三个剂量组,腹腔注射(i.p)给药。记录给药期间各组裸鼠荷瘤体积及体重变化,处死动物前取血清测定裸鼠体内激素水平;(8)小鼠急性毒性试验初步考察目标化合物H10的安全性,处死动物后取脏器进行组织形态学观察。结果:(1)利用LC540(17β-HSD3)细胞株筛选出3个有潜力的姜黄素衍生物:H1、H10和H11。其中H10显著降低了 LC540(17β-HSD3)细胞上清中睾酮水平,但对孕酮水平无影响;而H1和H11同时降低了睾酮和孕酮水平,其他化合物则对睾酮和孕酮水平无影响;(2)H10处理LC540(17β-HSD3)细胞株后可下调17β-HSD3基因的表达水平,且具有剂量依赖性;0.25、0.5和1 μmol/L三个浓度的H10均显著下调了 17β-HSD3蛋白的表达(P<0.05),但对睾酮合成通路上的StAR、CYP11A1、CYP17和3β-HSD的表达无显著影响;(3)0、10、20和40 μmol/L的H10处理睾丸微粒体后,体系中睾酮浓度分别为1.19±0.07ng/ml、0.90±0.10ng/ml、0.56±0.06ng/ml、0.49±0.09ng/ml;(4)SD 大鼠连续腹腔注射给药七天后(10、30和50 mg/kg/d),体内睾酮水平显著下降,且呈现剂量依赖性,而孕酮水平保持不变;(5)H10给药组裸鼠的肿瘤体积增长明显慢于生理盐水组和溶剂组(P<0.05)。生理盐水组、溶剂组、H10给药组(低、中、高)的肿瘤体积分别为510.80±99.08mm3、494.49±81.91 mm3、424.45±95.24mm3、243.67±58.49mm3、269.44±78.98 mm3;各组裸鼠血清睾酮水平分别为 1.53 ±0.56 ng/ml、1.41 ±0.65 ng/ml、0.41 ±0.30 ng/ml、0.22±0.07ng/ml、0.19±0.16 ng/ml(means±SD,n=6);(6)小鼠腹腔注射H10后(因溶解度原因最高剂量为100 mg/kg)在实验剂量范围内对KM小鼠无不良影响,病理切片显示心、肝、脾、肺、肾和睾丸组织结构正常。结论:本研究以17β-HSD3为靶点,从一系列姜黄素衍生物中筛选出了其选择性抑制剂H10,并进一步通过体内外实验验证了 H10对17β-HSD3基因和蛋白表达的抑制作用。在LNCap细胞株前列腺癌裸鼠模型中,H10能有效降低裸鼠体内睾酮水平并抑制肿瘤的生长。结果显示,姜黄素衍生物H10是一种潜在的以17β-HSD3为靶点的小分子抑制剂,可作为前列腺癌治疗药物进行进一步的研究。