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目的:放射诱导肺纤维化是临床胸部肿瘤放疗后不可逆的并发症,通过建立放射诱导肺纤维化的小鼠模型,进一步探讨Ⅱ型肺泡上皮干细胞(AEC Ⅱ)在损伤修复过程中的作用以及与纤维化有关的因子的表达水平,以期发现放射性肺纤维化的可能机制。方法:第一部分放射性肺纤维化小鼠模型建立:购买8周龄C57BL/6j雌性小鼠112只,该品系的雌性小鼠已被证实对射线敏感。按随机数字法分为实验组71只和对照组41只。小鼠麻醉后,固定于固定板上,使被照射小鼠胸部处于同一直线上。在模拟定位机下定位全肺组织,然后实验组给予全胸部单次20Gy的X线照射,对照组则进行模拟照射(0Gy)。照射后记录意外死亡小鼠,按照射后24小时、1周、1-6月这8个时间点处理实验组及对照组小鼠,每组各5只。取小鼠肺组织,右肺即刻液氮冰冻后–80℃保存,用于Western blot及RT-PCR,而左肺固定于中性福尔马林后制成蜡块。蜡块切片按照H&E染色试剂盒、Masson染色试剂盒和天狼星红染色试剂盒说明书染色。由病理科医生判断肺不同阶段损伤程度和纤维化发生的病理变化,确认纤维化模型成功建立。第二部分观察Ⅱ型肺泡上皮细胞动态表型和纤维化相关因子表达水平:Ⅱ型肺泡上皮细胞表面活性蛋白C(Surface active protein C,pro SP-C)被用作肺泡Ⅱ型细胞的标志物;I型肺上皮细胞标志蛋白(Homeobox only protein X,HOPX),被作为I型肺泡细胞的标志物;波形蛋白(Vimentin)作为间质细胞标志物;转化生长因子β1(Transforming growth factor,TGF-β1)和β-连环蛋白(β-catenin)与肺纤维化诱导发生密切相关。对于照射后2-6个月(肺纤维化发生于照射后3个月)的肺组织,通过免疫双标荧光染色,确定Ⅱ型肺泡细胞动态表型的改变。再用Western blot和RT-PCR对其蛋白及m RNA的表达进行定量分析,进一步明确肺纤维化的可能机制。结果:第一部分:对小鼠胸部单次20Gy的X射线照射可以导致不同程度的肺损伤:照射后24h至1个月,细支气管粘膜慢性炎伴被覆上皮增生,局灶肺泡腔内出血、充血,散在炎细胞浸润。照射后2个月,间质可见血管扩张充血,纤维组织增生。照射后3个月,小鼠肺发生局部纤维化,照射后5个月则出现明显纤维化。第二部分:1.pro SP-C结果:免疫荧光染色的结果显示,在照射后3个月的实验组小鼠肺组织中,Pro SP-C阳性细胞(Pro SP-C+)的密集程度较对照组开始下降,至放射后5、6个月可见散在几个Pro SP-C+细胞,较对照组显著下降(如图4a)。并且在Western blot及RT-PCR结果中显示,实验组小鼠肺组织中Pro SP-C蛋白及其m RNA的表达在照射后2-6个月均出现较对照组显著减少(如表2-1及表2-2)。2.HOPX结果:Pro SP-C/HOPX免疫荧光染色共表达结果显示,实验组在照射后3个月,小鼠肺组织中可见散在的Pro-SP及HOPX共表达细胞(pro SP-C+/HOPX+),照射5个月后肺组织中未见有pro SP-C+/HOPX+细胞。然而对照组在照射后3-6个月则持续出现此类细胞,同时发现实验组HOPX+细胞在照射后5个月较对照组显著减少(如图4b)。此外Western blot及RT-PCR结果中显示,实验组小鼠肺组织中HOPX蛋白及m RNA定量在照射后4-6个月较对照组显著减少(如表2-1及表2-2)。3.Vimentin结果:Pro SP-C/Vimentin免疫荧光染色共表达结果显示,实验组中pro SP-C及Vimentin的共表达细胞(pro SP-C+/Vimentin+)细胞在照射后3个月开始出现,5个月后明显增多,而对照组中均无此共表达细胞(如图4c1,4c2)。另外在Western blot结果中显示实验组小鼠肺组织中Vimentin蛋白定量在照射后2-6个月均较对照组增多(如表2-1)。4.TGF-β1结果:免疫荧光染色的结果显示,实验组在照射后3个月TGF-β1阳性细胞(TGF-β1+)明显增多,5、6个月后可见大量TGF-β1+细胞,而对照组中有少量此类细胞。Western blot及RT-PCR结果显示实验组小鼠肺组织中TGF-β1蛋白及m RNA定量在照射后2个月较对照组减少,而照射后3-6个月较对照组明显增多(如表2-1及表2-2)。5.β-catenin结果:免疫荧光染色的结果显示,实验组在照射后3个月,β-catenin阳性细胞(β-catenin+)明显增多,5、6个月后可见大量β-catenin+细胞,而对照组中有少量此类细胞。Western blot及RT-PCR结果显示,实验组小鼠肺组织中β-catenin蛋白及m RNA定量在照射后3-6个月较对照组增多(如表2-1及表2-2)。结论:通过给予8周龄C57BL/6j雌性小鼠全胸部20GY的单次照射,成功建立肺纤维化小鼠模型。还通过观察实验组小鼠纤维化肺组织,在照射后出现pro SP-C+细胞及pro SP-C+/HOPX+细胞的减少,而pro SP-C+/Vimentin+细胞及TGF-β1+细胞的增多,与Western blot及RT-PCR结果一致,暗示着Ⅱ型肺泡上皮干细胞不分化为Ⅰ型细胞,而是转化为分化成间质细胞的可能。此外免疫组化,Western blot及RT-PCR也证实肺纤维化组织中TGF-β1和β-catenin同时增加,并且国内外文献证实TGF-β1与β-catenin之间有多条通路及相互作用。所以我们推测TGF-β1与β-catenin可能参与调节Ⅱ型细胞的分化。