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继可逆电穿孔效应辅助化疗药物治疗肿瘤和不可逆性电穿孔直接杀死肿瘤细胞后,新近研究出一种以内处理效应为治疗基础的纳秒级陡脉冲。其治疗原理并不是破坏细胞膜而是使细胞核、线粒体、内质网等细胞器出现一系列功能性改变及细胞信号转导的变化,从而诱导细胞凋亡。目前纳秒级陡脉冲诱导凋亡的研究集中在如磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)外翻、线粒体膜电位改变,细胞内游离钙离子浓度的改变、形态学的证据等,对具体的凋亡通路并没有系统深入的研究。我们通过Annexin V/PI双染技术检测不同参数组陡脉冲处理细胞后的凋亡率,找出最佳治疗参数,用DNA Ladde检测确定凋亡的存在,通过caspase12蛋白证明内质网凋亡通路可能是其诱导凋亡的机制之一,螯合细胞内因陡脉冲处理增高的游离钙离子后,检测细胞存活率,细胞凋亡率及caspase12蛋白表达的变化。探讨了纳秒级陡脉冲诱导卵巢癌细胞凋亡的内质网机制。为临床使用纳秒级陡脉冲治疗恶性肿瘤提供新的理论依据。第一部分纳秒级陡脉冲诱导人卵巢癌细胞凋亡及最佳参数的确定目的:探讨纳秒级陡脉冲对人卵巢癌细胞的凋亡诱导作用及最佳参数的确定。方法:用不同参数组的纳秒级陡脉冲处理细胞后,Annexin V/PI双染流式细胞仪检测其凋亡率及死亡率。找出最佳治疗参数;琼脂糖凝胶电泳其DNA条带;以最佳治疗参数的纳秒级陡脉冲处理细胞后,应用Western blot技术检测caspase12蛋白的表达水平。结果:Annexin V/PI双染流式细胞术结果示:最佳治疗参数为场强90KV/cm;脉宽:100ns;脉冲作用时间:30s;频率:1Hz,其凋亡率最高(64.01±5.07)% ,坏死率为(0.71±0.37)%;琼脂糖凝胶电泳的电泳谱呈180-200bp及其倍数的DNA梯状条带;以最佳治疗参数的纳秒级陡脉冲处理卵巢癌细胞后,Caspase-12蛋白表达水平与对照组相比,0h(0.43±0.10)无明显差异(P>0.05),而2、6、12h(分别为0.74±0.11、1.03±0.10、0.91±0.15)Caspase-12表达升高,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论:纳秒级陡脉冲能明显诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡,内质网凋亡通路可能是其诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡的机制之一。第二部分纳秒级陡脉冲诱导人卵巢癌细胞凋亡的内质网机制的研究目的:探讨钙离子在纳秒级陡脉冲诱导人卵巢癌细胞内质网凋亡通路中的作用。方法:用0μ、25μ、50μ、100μmol/L BAPTA-AM分组螯合细胞内因纳秒级陡脉冲处理而增高的游离Ca2+后,MTT检测细胞存活率,Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡率,Western-blot技术检测caspase12蛋白表达的变化。结果:BAPTA-AM作用过的细胞经纳秒级陡脉冲处理后细胞存活率明显高于单用纳秒级陡脉冲处理的细胞(P<0.05),凋亡率也同时降低(P<0.05), Caspase-12蛋白表达水平也相应降低(分别为0.41±0.57,1.02±0.91,0.56±0.64,0.76±0.61)差异均有统计学意义(P均<0.05)结论:通过拮抗细胞内游离钙离子增高,可抑制纳秒陡脉冲诱导卵巢癌细胞SKOV3发生凋亡。细胞内游离钙离子升高及其可能介导的内质网凋亡通路是纳秒级陡脉冲诱导人卵巢癌细胞凋亡的机制之一。