论文部分内容阅读
目的：构建含有目的基因IL-24的真核表达质粒pEGFP-N1-IL-24,将其转染小鼠黑色素瘤B16细胞,研究IL-24在细胞内表达对肿瘤细胞的凋亡和体外增殖的影响。方法：将pUC57-IL-24用限制性核酸内切酶双酶切后,经琼脂糖凝胶电泳回收、纯化,与pEGFP-N1相连接,将连接产物转化至感受态细胞E.coli DH5a中,提取质粒,再次酶切电泳,检查IL-24插入pEGFP-N1的准确性,并进行测序验证。用脂质体法将pEGFP-N1-IL-24转染B16细胞(B16/pEGFP-N1-IL-24组),同时设未处理的B16细胞(B16组)作对照组,另外将只加入脂质体的B16细胞(B16/Lip组)作脂质体组,pEGFP-N1转染的B16细胞(B16/pEGFP-N1组)作空载体组,加入长春新碱的B16细胞(B16/VCR组)作化疗药组,24h后在荧光显微镜下观察各组细胞的表达,于转染48h后在倒置显微镜高倍镜下观察细胞的形态学变化,用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)法检测细胞凋亡,用MTT法检测B16细胞的体外增殖能力,实验结果用x±s表示,用统计软件做t检验,P<0.05时有显著性差异。结果：1.将构建的含有IL-24的真核表达质粒经酶切、电泳,发现了4.7kb和660bp的条带,与预期值相符,经测序验证为pEGFP-N1-IL-24基因序列。2.将B16、B16/Lip、B16/pEGFP-N1、B16/pEGFP-N1-IL-24、B16/VCR五组细胞分别于转染后24h在荧光显微镜下观察,可见B16/pEGFP-N1组细胞和B16/pEGFP-N1-IL-24组细胞发出绿色荧光,说明EGFP基因在B16细胞中有表达,而其他组细胞未见绿色荧光。3.观察B16、B16/Lip、B16/pEGFP-N1、B16/pEGFP-N1-IL-24、B16/VCR五组细胞在转染后48h的细胞形态,可见,B16组、B16/Lip组和B16/pEGFP-N1组细胞,因细胞分裂增殖而满视野,细胞大小类似,呈圆形、椭圆形或短梭型,细胞外周清晰,立体感强。B16/pEGFP-N1-IL-24组和B16/VCR组细胞,大多细胞的周边较模糊,成团紧密聚集,细胞数量少,有碎片,大小不规则。4. B16、B16/Lip、B16/pEGFP-N1、B16/pEGFP-N1-IL-24、B16/VCR五组细胞分别进行AO/EB双荧光染色,结果表明B16组、B16/Lip组和B16/pEGFP-N1组细胞大多为核染色质着绿色,并呈正常结构,有少量死亡细胞,即核染色质着红色并呈正常结构；B16/pEGFP-N1-IL-24组和B16/VCR组细胞大多为凋亡细胞,核染色质为橘黄色或橙红色,并呈固缩状或圆珠状。5.将B16、B16/Lip、B16/pEGFP-N1、B16/pEGFP-N1-IL-24、B16/VCR五组细胞用MTT进行比色法测定,B16/pEGFP-N1-IL-24组与B16/Lip组、B16/pEGFP-N1-IL-24与B16/pEGFP-N1的抑制率有显著性差异(P<0.05,P<0.05),而B16/pEGFP-N1-IL-24组与B16/VCR组的抑制率无明显差异(P=0.991)。由转染后48h,B16细胞由抑制率而做的直方图可以看出,B16/pEGFP-N1-IL-24组和B16/VCR组细胞的增殖与B16/Lip组和B16/pEGFP-N1组相比明显受到抑制。结论：1.成功构建了重组表达质粒pEGFP-N1-IL-24,并通过酶切、电泳和基因测序验证了其基因序列的正确性。2.外源性IL-24基因可以体外转染小鼠黑色素瘤B16细胞,并在B16细胞中表达。3.外源性IL-24基因可诱导小鼠黑色素瘤B16细胞发生凋亡,抑制其在体外增殖。4.IL-24基因作为黑色素瘤的治疗基因,具有广阔的应用前景。