人干扰素-γ（human interferon-γ，hIFN-γ）是一种常见的天然糖蛋白，属于干扰素（Interferon，IFN）家族的一员，具有多种生物活性。根据蛋白来源和结构不同可将IFN家族分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，而hIFN-γ属于Ⅱ型IFN，其主要通过作用于巨噬细胞及T细胞来调节机体免疫来达到抗病毒的效果，而体外研究发现IFN-γ可抑制体外培养癌细胞的增殖并诱导其凋亡，同时对多种移植瘤模型亦有效，表明其有较好的抗肿瘤潜能。以上提示IFN有巨大的临床应用前景。乳腺癌发病率和死亡率均较高，是最常见的女性恶性肿瘤，预后极差。其异常生物学行为是导致难以治愈的关键因素，故探讨有效的抑制乳腺癌增殖、侵袭和转移的策略，对降低乳腺癌患者术后复发及延长生存期有重要意义。研究表明IFN-γ具有抗肿瘤活性，本研究以此为研究基础，探讨IFN-γ在抑制乳腺癌增殖、侵袭及转移方面的作用。获得大量的高纯度的hIFN-γ对临床研究及其机制研究有重要意义。但由于天然hIFN-γ来源有限，故需借助生物工程技术进行大规模制备。先前报道指出可采用腺病毒、大肠杆菌、酿酒酵母及中国仓鼠卵巢细胞来制备重组hIFN-γ（rhIFN-γ），但操作工艺复杂、生产成本高及产量和生物活性降低限制了以上表达系统的应用。本研究应用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统制备出与hIFN-γ组分相似的rhIFN-γ制剂，同时通过体内和体外实验检测了该生物制剂的生物学活性，取得以下结果：一、rhIFN-γ毕赤酵母表达载体的构建、表达、纯化及活性检测1.成功构建了重组人干扰素-γ的分泌型表达载体pPICZ-rhIFN-γ，利用巴斯德毕赤酵母表达系统稳定分泌表达了rhIFN-γ。2.免疫印迹及N末端测序显示rhIFN-γ成功表达，从毕赤酵母培养液分离和浓缩后，采用阳离子交换色谱系统进行纯化。从5L的培养基中共获得总量为0.601g的rhIFN-γ。TRICINE-SDS-PAGE电泳及高效液相色谱显示获得rhIFN-γ的纯度为95.6%。二、rhIFN-γ的抗肿瘤活性采用乳腺癌常用细胞株MDA-MB-231及乳腺癌皮下移植瘤模型分别在体外、体内水平研究rhIFN-γ的抗肿瘤作用。1.体外水平：rhIFN-γ能呈时间依赖的方式抑制癌细胞生长、提高凋亡率及凋亡指数、阻滞细胞周期并抑制PI3K/Akt信号通路的激活。2.体内水平：rhIFN-γ能降低乳腺癌皮下移植瘤模型的成瘤率、降低血清及瘤内血管内皮生长因子水平，显著降低肿瘤组织中的MMP-2和MMP-9的表达。本研究的创新之处在于：(1）建立了利用巴斯德毕赤酵母高效分泌表达rhIFN-γ的真核表达系统；(2）通过Tricine-SDS-PAGE、免疫印迹及氨基酸直接测序技术鉴定rhIFN-γ，阳离子交换色谱系统纯化得到高纯度rhIFN-γ；(3）在体外水平、体内水平证实rhIFN-γ具有广泛的抗肿瘤作用。