论文部分内容阅读
一、研究目的 体外观察叶下珠复方抗HBV及抑制HBsAg、HBeAg分泌的作用,在动物体内观察叶下珠复方对免疫性肝损伤的保护作用,并初步揭示其护肝机制;研究叶下珠复方的体内和体外抗肿瘤活性,并探讨其抗肿瘤的分子生物学机制。 二、实验步骤 1.观察叶下珠复方体外抗HBV的作用 2.叶下珠复方抗ConA所致的免疫性肝损伤 3.叶下珠复方对人肝癌HePG2细胞体外增殖的抑制作用 4.建立人肝癌HePG2裸鼠移植瘤模型 5.叶下珠复方的体内抗肿瘤作用 6.用RT-PCR、分子克隆、基因序列测定和免疫组化等方法观察叶下珠复方对移植瘤裸鼠p53、c-myc基因表达的调节作用。 三、实验方法 1.以2.2.15细胞为模型,根据MTT法检测叶下珠复方的细胞毒性。用公式求算出药物的最大无毒浓度及半效致死量TC50。将2.2.15细胞按1×105/ml接种24孔细胞培养板,每孔1.2ml,次日弃培养液。以不同药物对2.2.15细胞的最大无毒剂量为起始浓度,加入培养液稀释（系列2倍稀释）的不同浓度的不同药物,每浓度6孔,每3天换含药物的培养液一次,同时设不加药物对照。收集每次换液的培养上清250ul,-20℃冻存,集中用ELISA法测定HBsAg、HBeAg,并计算药物对抗原的抑制率、半数有效浓度（IC50）和治疗指数（TI）,判断药物效果,用荧光定量PCR测定HVB-DNA。 2.NIH小鼠48只随机分为6组,每组8只,分别为空白对照组,模型对照组,叶下珠复方大、中、小剂量组（40g/kg、20g/kg、10g/kg）,联苯双酯（150mg/kg）治疗组,除空白对照组外,其余小鼠于实验首日上午尾静脉注射ConA 20mg/kg,4h后各组开始灌胃给药,空白对照组和模型对照组均灌等量生理盐水,次日晨开始第二次给药,第三天给药后4h第二次尾静脉注射ConA 20mg/kg,8h后取摘眼球取血,赖氏法检测ALT、AST,ELISA法检测TNF-α和IL-8含量。肝脏取出后取左叶中性甲醛固定,石蜡