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目的:
探讨腺病毒介导的RNA干涉(RNA interference,RNAi)沉默存活素(Survivin)表达后,诱导人乳腺癌细胞株MCF-7凋亡的情况,并进一步研究Survivin表达受抑制后对MCF-7细胞裸鼠人乳腺癌移植瘤的抑制作用。
方法:
以Shuttle Vector 1.0-CMV 为载体构建人 survivin基因的4个短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,其中一个为阴性对照;脂质体法将质粒转染人乳腺癌细胞株MCF-7,通过比较各mRNA的转录水平筛选出沉默效果最强的表达质粒。构建携带所筛选的survivin shRNA表达质粒和阴性对照质粒的重组腺病毒(Ad-survivin 和 Ad-control);流式细胞术检测该腺病毒介导的 RNAi效应。建立人乳腺癌肿瘤模型:将MCF-7细胞种植到Blab/c-nu/nu 裸小鼠的右前肢腋下;将成瘤的裸鼠随机分为三组,分别予 PBS、Ad-control 病毒悬液和Ad-survivin病毒悬液行瘤周和瘤体注射,同时观察肿瘤生长情况;药物处理结束后,收集标本,常规制片观察组织学情况,并通过免疫组织化学检测Survivin蛋白表达情况。
结果
成功构建针对人surviin shRNA的表达质粒;RT-PCR法筛选出沉默效果最强的质粒。成功构建携带人survivin shRNA 表达质粒的重组腺病毒;流式细胞术检测:腺病毒介导 surviv shRNA 作用 MCF-7 细胞后导致细胞凋亡。成功建立人乳腺癌肿瘤模型;给药后实验组移植瘤的生长速度慢于对照组;免疫组织化学检测发现实验组的Survivin蛋白表达受到抑制。
结论:
1.构建的人survivin shRNA 表达质粒,从 mRNA 水平证实对人乳腺癌细胞MCF-7 的 survivin 表达实现特异性的抑制;重组腺病毒介导该表达质粒进入MCF-7 细胞,并有效地促进细胞走向凋亡。因此,survivin 可以作为乳腺癌治疗的重要靶点。
2.腺病毒介导的survivin shRNA 能有效地抑制裸鼠人乳腺癌移植瘤组织中survivin表达,抑制肿瘤的增长趋势。因此,以腺病毒为载体,以 survivin 为靶点RNAi介导的基因治疗方法有望成为乳腺癌一种新的治疗策略。