【研究背景及目的】基因治疗在医学领域的应用随着技术的进步而逐渐深入,基因转导载体是基因治疗中一个关键因素。腺病毒是可以感染人类但仅能引起轻微病变的一种双链DNA病毒,其在基因治疗中所表现出来的优点使其成为一个很有希望的载体。到目前为止,腺病毒载体在基因治疗的基础研究和临床研究中都占据了很大的比重,该类型已经发展到了第三代载体。第一代腺病毒载体在基因治疗研究所表现出的缺点,使其不能很好地应用于某些特定疾病的治疗中,比如一些遗传病、慢性疼痛的治疗。与第一代腺病毒载体相比,第三代腺病毒载体(HDAd)的优点主要体现在其所携带的转基因的装载容量和表达时间以及对机体引起的免疫反应方面,这也使得HDAd成为当今基因治疗领域的研究热点。腺病毒载体所携带的转基因都有较高水平的表达,但转基因的表达不仅取决于所采用的基因转导载体,其表达水平还决定于驱动转基因表达的启动子等因素。本研究中所要表达的治疗性蛋白是需要分泌表达至细胞外才能转移至作用位点发挥其生物活性作用的,所以构建的转基因中目的蛋白的DNA序列翻译出来的多肽链需要在信号肽的引导下才能转运出细胞,所以在构建融合基因过程中所采用的信号肽序列也是影响融合基因表达产物细胞外水平的一个重要因素。慢性疼痛在医学界一直是一个顽疾。如何有效地治疗慢性疼痛,减轻慢性疼痛患者的痛苦是科研工作者的一个重要课题。许多的研究结果已经证实基因治疗能够应用于慢性疼痛的治疗。疼痛的传统治疗方案在临床治疗中所具有的一些副作用在使病患者得到治疗的同时在给众多患者带来了额外的痛苦,而当今成为研究热点的基因治疗使这些副作用成为历史。β-内啡肽是机体内源性镇痛系统的一个重要成份,在机体镇痛的机制中有重要地位,它能影响着伤害感受性信号上行传导至高级中枢形成痛觉的信号传导通路。已有研究表明β-内啡肽能够有效地治疗慢性疼痛,但研究尚不充分。本课题在先前研究工作的基础上,继续开展对低毒性的重组腺病毒载体的研究,探讨其携带的转基因表达的产物对慢性疼痛模型的治疗作用,以期促进基因治疗在慢性疼痛中应用的发展。【方法】1.获得人基因组DNA后,通过SOE-PCR的方法将人源神经生长因子信号肽的DNA序列与人源β-内啡肽的DNA序列相融合,在拼接处嵌入能够为细胞内特殊水解酶FURIN所能识别的序列,形成能够实现分泌表达的融合蛋白表达序列。DNA片段测序正确后,将表达片段克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)内,构建成功能够分泌表达人源β-内啡肽的真核表达载体pCDNA3.1(+)-HNE,同时也构建了具有小鼠神经生长因子信号肽的能分泌表达人源β-内啡肽的真核表达载体pCDNA3.1(+)-NEP;之后按照质脂体转染法将两个不同的表达载体分别转染体外培养的NIH3T3细胞,在转染后的72小时收集细胞培养上清液,RIA法测定上清液内蛋白β-内啡肽的浓度,对两种信号肽引导分泌表达的效率进行比较。2.将两个FRT位点序列同向连接于穿梭质粒载体中腺病毒包装信号的两侧;核酸内切酶PmeI将穿梭质粒载体pSH-2FRT线性化,然后转化BJ5183-AdEasy-1的感受态细胞;线性化的穿梭质粒载体pSH-2FRT在细菌内与pAdEasy-1病毒骨架质粒发生同源重组,形成第一代腺病毒载体的质粒载体,即辅助病毒载体pAd-HELPer,后者经鉴定正确后用核酸内切酶PacI释放病毒基因组DNA;病毒基因组DNA按质脂体法转染六孔板培养的HEK293细胞进行重组病毒的包装,10天后收获重组成功的病毒Ad-HELPer;在经PCR鉴定病毒液中没有RCA病毒的污染后进行病毒的扩增,扩增后的病毒液测定滴度。3.将融合基因的DNA片段转移到低毒的重组腺病毒载体的骨架质粒载体内,形成包装低毒重组腺病毒的载体pST-HNE;重组腺病毒基因组DNA用内切酶PmeI释放后纯化备用;病毒骨架DNA转染HEK293F细胞后再感染辅助病毒Ad-HELPer,2-3天收获包装成功的低毒腺病毒,再用收获的病毒粗纯液和辅助病毒Ad-HELPer共同感染培养的HEK293F细胞继续扩增低毒腺病毒;经过扩增,收集含有病毒的细胞,3次冻融裂解细胞,离心后获得病毒粗纯液,氯化铯梯度密度离心法纯化病毒,PD-10纯化滤柱脱去氯化铯,在无菌条件下分装于新离心管内;利用实时定量PCR法测定低毒腺病毒的滴度、辅助病毒的滴度,并检测有否RCA病毒的存在,计算出辅助病毒的含率。4.按MOI=5的病毒用量将病毒感染培养的NIH3T3和HEK293细胞,感染后48小时抽提细胞的总RNA,再反转录成cDNA,普通PCR法间接检测融合基因转录的mRNA;将无菌的盖玻片置于六孔板孔内,接种NIH3T3细胞,次日细胞贴在盖玻片上生长后用病毒感染NIH3T3细胞,48小时后收集盖玻片,细胞洗涤固定后进行细胞免疫荧光染色,检测细胞内β-内啡肽的表达及分布;病毒(MOI=5)感染NIH3T3细胞,在感染后不同时间点收集细胞培养上清液,RIA法测定上清液中β-内啡肽的浓度,归纳β-内啡肽的表达分泌趋势。5.在建立SD大鼠的CCI模型后,将两种重组腺病毒HDAd-HNE和Ad-NEP分别注射入大鼠的腰段蛛网膜下腔,在注射后不同时间测定各组动物右后足的辐射热痛阈,分析大鼠痛阈的变化;抽取每组动物脑脊液,RIA法测定β-内啡肽的浓度,分析脑脊液内治疗蛋白的浓度变化趋势;注射病毒后的第三天,实验动物在麻醉状态下进行4%的多聚甲醛心脏灌注,结束后取其腰段脊髓组织,切片进行组织免疫荧光染色,观察重组病毒对脊髓组织的感染情况,以及病毒携带的融合基因在脊髓组织内的表达;线性回归分析实验动物的辐射热痛阈与脑脊液中β-内啡肽浓度之间的相关性。【结果】1.成功构建了分别带有人和小鼠的神经生长因子信号肽的分泌表达人β-内啡肽的真核表达载体,转染NIH3T3细胞后培养液中可以检测到β-内啡肽,提示两个信号肽均可以实现融合基因的分泌表达。检测结果显示,pCDNA3.1-NEP与pCDNA3.1-HNE所携带的融合基因表达产物水平之间有显著差异(p＜0.05),且两者分别与空白对照载体pCDNA3.1(+)之间也存在显著差异(p＜0.01),提示两个信号肽的分泌表达作用的效率存在差异,其中来自于人的神经生长因子信号肽的分泌表达效率要高于小鼠的信号肽序列,前者比后者提高约50%。2.成功构建辅助病毒Ad-HELPer,经PCR检测未能得到病毒液中存在RCA病毒的证据,辅助病毒Ad-HELPer扩增并粗纯后测定滴度为3.67E+9(PFU/ml)。3.在得到正确的低毒腺病毒质粒载体pST-HNE后转染HEK293F细胞并在辅助病毒感染后包装出低毒腺病毒HDAd-HNE;在辅助病毒的共感染条件下,扩增了HDAd-HNE,氯化铯梯度密度离心法纯化并脱盐后利用实时定量PCR测定HDAd-HNE的滴度为2.59E+12 genomes/ml,辅助病毒的含率为0.16%,且没有在病毒液检测到RCA病毒。4.感染有病毒的NIH3T3、HEK293细胞内间接检测到了转录的mRNA片段;感染重组病毒后48小时的NIH3T3的细胞免疫荧光染色结果显示,HDAd-NHE、Ad-NEP携带的融合基因在NIH3T3细胞内均能表达,表达产物弥散在细胞浆内,细胞核内没有发现;不同时间点的细胞培养上清液中均检测到beta-内啡肽,第一天已有较高浓度;第三天的beta-内啡肽浓度比第一天高,第七天的浓度最高,均与空白对照样品有显著差异(p＜0.01),HDAd-HNE组与Ad-NEP组的浓度之间存在显著差异(p＜0.05),Ad-NEP感染的NIH3T3培养上清液中内啡肽的浓度高于经HDAd-HNE处理的培养上清液。5.成功地建立大鼠的CCI慢性疼痛模型,大鼠腰段蛛网膜下腔注射病毒后第三天的脊髓组织免疫荧光染色结果提示重组病毒携带的融合基因在蛛网膜下腔软脊膜细胞内发生表达;表达β-内啡肽对大鼠的基础痛阈没有产生影响;Ad-NEP和HDAd-HNE在软脊膜细胞中表达的β-内啡肽进入脑脊液,第3天到达峰值之后于后期开始下降或者维持至观察期未,其浓度均与对照组有显著的差异(p＜0.05);注射病毒的CCI大鼠后足痛阈与对照组有显著差异(p＜0.05),但由于Ad-NEP表达的β-内啡肽后期下降,该组的痛阈又接近治疗前水平;线性相关性分析结果显示痛阈变化与β-内啡肽的浓度之间存在相关性,提示大鼠的痛阈变化是由病毒表达的β-内啡肽造成的。【结论】人源的神经生长因子信号肽与小鼠信号肽在引导蛋白多肽分泌表达的效率之间有差异,且人源的信号肽的效率要高于小鼠源的信号肽。构建的辅助病毒在低毒腺病毒的生产中发挥了辅助作用,包装出了低毒腺病毒。体外细胞和动物体内研究均显示低毒腺病毒和第一代腺病毒能正常表达β-内啡肽,并分泌至细胞外,但低毒腺病毒的表达水平较第一代腺病毒低。病毒中融合基因表达的β-内啡肽具有生物活性,对CCI大鼠有治疗作用,改变了CCI大鼠的痛阈。