论文部分内容阅读
随着荧光成像技术的不断发展,具有灵敏度高、选择性好、响应快速并可实现实时、原位检测等优点的荧光探针在食品安全、环境监测、生物成像、疾病诊断等领域的研究取得了显著成就,展现了巨大的应用潜力。利用分子荧光探针监测生命活动事件,对深入了解相关生理和病理过程、疾病诊断和治疗具有十分重要的意义。虽然传统荧光分子探针技术得到了很大地发展和改善,其在生化分析领域也得到了广泛地应用,但是传统荧光分子探针存在耐光漂白能力差、生物背景荧光较大、组织穿透深度低以及不能原位成像等缺点,这些在很大程度上限制了荧光探针在生物体内的应用。为了更好地满足生物分析实际应用的需求,设计和开发性质优良的荧光探针仍然是当前研究的热点。实时监控细胞、活体内生物分子的浓度变化和分布情况对于研究其生理和病理功能、鉴定疾病生物标志物以及疾病的早期诊断具有非常重要的意义。基于荧光探针的荧光成像技术因具有灵敏度高、能够实现时空分辨成像、对活细胞和组织损伤小等优点,已成为监测疾病生物标志物强有力的工具。双光子荧光共聚焦成像以低能量的近红外光作为激发光源,具有更好地三维空间定位能力,更深的组织穿透能力,可降低光漂白和光损伤等优点,近年来得到了越来越多的关注。近红外荧光探针在活体成像中具有不可替代的优势,一直是研究的热点。然而大多数的荧光探针不能够实现目标物的原位成像,且荧光分子容易扩散导致荧光信号衰减较快,固态发光类荧光探针为解决这些问题提供了新的思路。本论文以长波长激发技术能够消除生物背景干扰、固态发光探针能够提高细胞内自定位能力为出发点,结合双光子荧光成像技术、近红外荧光成像及固态发光荧光染料的优势,构建了一系列新型灵敏度高、选择性好的分子荧光探针,并成功将其应用于与生命活动密切相关的小分子、酶等目标物的检测和生物成像研究。基于分子荧光探针的设计策略,构建了一个诊疗分子前药,用于肿瘤的化学/光动力学联合治疗。具体内容如下:（1）设计并合成了增强型双光子荧光探针用于检测光动力学治疗过程中产生的单线态氧。在第二章中,我们将线粒体靶向基团三苯基膦盐修饰在一种具有D-π-A结构的萘酐衍生物双光子荧光团上,并与单线态氧的捕捉基团9-甲基蒽连接起来,得到一个能够靶向线粒体的双光子单线态氧探针MNAH。9-甲基蒽对荧光团有着PET荧光猝灭机制,单线态氧和9-甲基蒽的特异性反应能够破坏后者的结构,成功的禁阻了 PET过程,实现了对单线态氧荧光增强型检测。探针MNAH对单线态氧响应快速,具有很好的选择性及线粒体定位能力。MNAH成功用于细胞和组织光动力学治疗过程中单线态氧的成像检测。（2）传统的双光子荧光染料的发射波长较短（<500 nm）,这个波段的光不利于穿透组织,这限制了双光子荧光探针在深层组织中的成像研究。在第三章中,我们设计合成了红光发射的双光子荧光探针平台NpRb。我们将D-π-A结构的萘衍生物双光子荧光团与具有红光发射的BODIPY衍生物通过共轭键链接起来,得到了具有大的双光子活性吸收截面、双光子近红外激发、红光发射的荧光探针平台。这种设计方法拓宽了双光子染料的种类,解决了传统双光子染料发射波长短的问题。以苯硫酚作为模型构建了荧光探针NpRb1,该探针表现了非常高的双光子荧光能量转移效率,实现了苯硫酚化合物的高灵敏、高选择性地检测,将其用于组织成像,得到了较深的组织穿透深度（90-220μ m）。（3）近红外荧光探针具有降低生物组织自发荧光、提高组织穿透深度等优点。在第四章中,我们设计合成了一个具有近红外激发近红外发射的荧光探针NALP,用于ALP活性检测。ALP是一种水解酶,催化水解蛋白质、非蛋白质底物的去磷酸基团过程。在很多组织器官中有表达,如肝、骨、肾。在一些疾病中ALP的活性会升高,因此在临床上,其已经被用于疾病诊断。在探针NALP中,磷酸酯基团保护了荧光团的羟基抑制了探针的荧光,ALP特异性水解探针的磷酸酯基团,增强了探针的分子内电荷转移,实现了荧光增强。该探针对ALP具有很好的选择性和高灵敏度。在pH 8.0的缓冲溶液中,荧光增强57倍,对ALP的线性响应范围为1 U/L-30U/L,检测下限可达0.28U/L（3σ/slope）。更重要的是,我们将NALP用于细胞、肿瘤组织及活体肿瘤内的ALP的成像研究,取得了令人满意的结果,表明了该探针在生物体系中的实际应用价值。（4）精准医疗是目前的研究热点。亚细胞靶向肿瘤治疗和原位监测治疗效果是非常有意义的研究。PDT被认为是一种比较安全的微创治疗。基于分子探针设计策略,我们设计合成了一个线粒体靶向的化学/光动力学联合治疗小分子前药。我们开发了一个能够被H2O2激活的近红外光敏剂NPS-H2O2,进一步将其与5’-脱氧-5-氟尿苷（5’-DFUR）结合起来,得到一个联合光敏剂和化疗药物的小分子前药PNPS。PNPS能够很好靶向线粒体,并被肿瘤细胞过表达的H2O2激活,释放近红外光敏剂和5’-DFUR,进而有效的杀死肿瘤细胞。PNPS是一个多功能线粒体靶向的分子诊疗药物,实现了肿瘤细胞成像,治疗,原位监测治疗效果等多重功能,突出了分子探针设计的重要性。（5）基于固态发光染料的优点,在第六章我们设计合成了一个新型的基于激发态分子内质子转移的固态发光染料HTPQ,并且基于它设计了一个肿瘤标志物—碱性磷酸酶（ALP）的探针HTPQA。固态发光染料,如四苯乙烯、HPQ,用于探针的设计已经被大量报道。然而,四苯乙烯或者HPQ的最大激发波长都在350 nm,这不利于这类探针在生物成像检测中的应用。因此,我们开发了一种新型固态发光染料,它的最大激发和发射波长分别在410 nm和550 nm,其荧光和疏水性质都可以通过保护其羟基来调控。HTPQA在水溶液里面没有荧光,当ALP剪切掉磷酸酯基团后,释放了强疏水的HTPQ,进而聚集,荧光显著的增强。细胞成像表明,HTPQA具有自定位原位成像的能力。同时,基于4-甲基-7-羟基香豆素的对比探针则在细胞内快速扩散,也无自定位原位成像能力。因此探针HTPQA克服了传统水溶性染料易扩散信号易衰减的缺点,展现了原位成像的能力。同时,我们将HTPQA用于骨肉瘤细胞和骨肉瘤切片中ALP活性的检测,成功的证明了不同骨肉瘤中的ALP活性不同,突显了探针在骨肉瘤诊断中的应用潜力。