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骨质疏松症(OP)是一种以低骨量和骨组织的微结构退化为特征的疾病,OP一般通过测量骨矿物质密度(BMD)来临床定义,BMD也是OP的唯一最佳预测因子,OP的病理学机制至今仍然是未明的。目前全基因组关联研究(GWAS)已经鉴定出许多与BMD相关的单核苷酸多态位点(SNP),这些SNP位点是与BMD有密切关联的,同时磷酸化修饰是蛋白质修饰中不可或缺的,几乎涉及人体所有生命活动。因此我们设计了这项探究与磷酸化有关的SNP(即PhosSNP)位点影响人体骨密度的具体机制的研究,该研究主要可以分成四节:第一节,基于现有的GWAS结果,挑选出对人体骨密度有显著影响的PhosSNP,并对需要具体研究的目标SNP进行生物信息学功能预测分析;第二节,构建包含目标PhosSNP的相应稳转染成骨和破骨细胞系；第三节,通过体外的细胞功能实验观察PhosSNP对成骨细胞的功能和细胞内蛋白质磷酸化水平的影响;第四节,通过体外的细胞功能实验观察PhosSNP对破骨细胞的功能和蛋白质磷酸化水平的影响。研究目的:根据BMD相关的GWAS结果报道,PhosSNP位点rs3755955与人体腰椎和股骨颈 BMD 密切相关(P=5.2×10-15,Beta=-0.05,N=77508;P=1.5×10-14,Beta=-0.05,N=83894)。本次研究旨在通过与骨相关的分子和细胞功能实验揭示PhosSNP rs3755955与BMD潜在的关联机制。研究方法:我们通过Phenotype-Genotype Integrator检索出与OP和BMD显著相关的SNP位点(P<1×10-8),筛选出里面的PhosSNP,根据已有的研究文献、数据库信息和研究可行性,确定本次研究的PhosSNP位点(rs3755955,major/minor allele:G/A),并预测rs3755955在IDUA蛋白质氨基酸序列中特异性磷酸化位点对蛋白质磷酸化变化的影响。我们以pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(PCDH)质粒为载体,构建包含SNP的野生型 IDUA(allele Gat rs3755955)(wild IDUA-R105)、变异型 IDUA(allele A at rs3755955)(variant IDUA-Q105)重组质粒,PCDH质粒作为空载对照,然后以野生型、变异型重组质粒和空载质粒转染hFOB和RAW264.7细胞,构建稳转染成骨和破骨细胞系。在成骨细胞中,我们通过实时荧光定量PCR实验观察PhosSNP对成骨功能标志物骨桥蛋白(OPN)、I型胶原蛋白A1(COL1A1)、矮小相关转录因子(Runx2)和核因子λB受体活化因子配体(RANKL)的表达水平的影响;通过CCK-8增殖检测试剂盒监测5天内PhosSNP对hFOB细胞增殖的影响;通过PE Annexin V凋亡试剂盒观察PhosSNP对hFOB细胞凋亡的影响;通过ALP-TRAP双染试剂盒检测碱性磷酸酶(ALP)染色来观察PhosSNP对成骨细胞分化活性的影响。在破骨细胞中,我们通过模拟RAW264.7细胞从C166上皮细胞的迁移实验来观察PhosSNP对RAW细胞跨内皮迁移能力的影响,通过实时荧光定量PCR实验观察PhosSNP对破骨功能标志物抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、核因子λB受体活化因子(RANK)、整合素αv(Integrinαv)、组织蛋白酶K(Cathcpsine K)和基质金属蛋白酶9(MMP 9)表达水平的影响;通过RTCA S16仪器实时监测并记录48小时里细胞指数(CI)的变化情况来反应PhosSNP对RAW264.7细胞增殖的影响;通过PE Annexin V凋亡试剂盒观察PhosSNP对RAW264.7细胞凋亡的影响;通过ALP-TRAP双染试剂盒检测TRAP染色并对分化后细胞核数量大于3的破骨细胞进行计数来观察PhosSNP对破骨细胞分化活性的影响。我们通过磷酸化检测试剂盒检测了 PhosSNP对hFOB和RAW264.7细胞总蛋白和IDUA蛋白磷酸化水平的影响。研究结果:我们通过荧光显微镜和RT-PCR实验确认重组IDUA基因在成骨(p<0.05)和破骨(p<0.05)细胞株中稳定高表达。hFOB细胞实时荧光定量PCR结果显示,与转染了野生型IDUA-R105相比,转染了变异型IDUA-Q105的hFOB显著降低细胞中成骨功能标志物OPN,COL1A1和RANKL的mRNA表达水平(p<0.01)。与转染了野生型IDUA相比,转染了变异型IDUA的hFOB显著抑制细胞增殖速度(p<0.05),促进细胞凋亡(p<0.001),并且抑制ALP活性,抑制成骨细胞分化。与转染了野生型IDUA相比,转染了变异型IDUA的hFOB细胞中总蛋白(p<0.05)和IDUA蛋白(p<0.01)磷酸化水平显著降低。与转染了野生型IDUA-R105相比,转染了变异型IDUA-Q105的RAW264.7细胞显著提升细胞跨内皮迁移能力(p<0.000 1),增加细胞中破骨功能标志物TRAP,RANK,Integrin αv和Cathcpsine K的mRNA表达(p<0.05),显著促进细胞生长,抑制细胞凋亡(p<0.01),并促进破骨细胞分化(p<0.001)。与转染了野生型IDUA相比,转染了变异型IDUA的RAW264.7细胞中总蛋白(p<0.05)和IDUA蛋白(p<0.05)磷酸化水平显著降低。研究结论:phosSNP rs3755955的突变等位基因A可显著降低蛋白质磷酸化水平,抑制成骨细胞功能、促进破骨细胞活性。新鉴定的rs3755955的骨细胞功能解释了以往的人群发现,即突变等位基因与较低的骨密度相关联。研究目的:外周血单核细胞(PBMC)对免疫系统至关重要,并参与多种人类疾病,包括类风湿性关节炎(RA)。PhosSNP能影响蛋白质的磷酸化修饰,因此可能调控细胞信号传导和基因表达。我们的目的是鉴定发现可能对RA有重要意义的由PhosSNP调节的基因网络和信号通路。研究方法:我们从中国样本人群的PBMC中收集全基因组PhosSNP基因分型数据和转录组的mRNA表达数据。我们从表达数据中查找发现与RA相关的差异表达基因(DEG)并在公共数据库中验证,将全基因组关联分析(GWAS)已发现的RA相关的PhosSNP在我们的样本数据中重复,然后对显著的RA相关的PhosSNP和DEG进行表达数量性状基因座(eQTL)分析。研究结果:我们鉴定出29个名义上显着的具有eQTL效应的PhosSNP和85个靶基因,并构建了全面的调控/相互作用网络,重点强调了 2个eQTL PhosSNP(rs371513和rs4824675,FDR<0.05)和 4 个重要的节点基因(HSPA4,NDUFA2,MRPL15 和 ATP50)。此外,由SNP rs371513调节的两个节点/关键基因NDUFA2和ATP50在线粒体氧化磷酸化途径中显着富集。我们在独立的全血和/或转化的成纤维细胞的eQTL结果中重复出四个eQTL效应的SNP-基因调控对。研究结论:该研究结果揭示了蛋白质磷酸化和基因遗传变异对RA的潜在重要作用,并强调出PhosSNP在调节PBMC中RA相关基因表达的重要作用。我们的结果指出了氧化磷酸化通路对RA的相关性和重要性。