目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)利用特定的诱导剂诱导分化为血管内皮细胞及MSCs单独或与必要的诱导因子组合移植治疗实验性大鼠股动脉闭塞症,为临床应用间充质干细胞移植治疗糖尿病足等血管闭塞性疾病提供实验依据。方法:1.大鼠间充质干细胞(MSCs)的分离培养、扩增与鉴定:选取健康0.2kg左右Wistar大鼠一只,麻醉后在无菌的条件下取股骨和胫骨,骨剪剪断关节处,用无血清DMEM冲出骨髓腔中的细胞后,用淋巴细胞分离液(比重1.077g/ml)密度梯度离心法分离单个核细胞(MNC),以含10%胎牛血清DMEM培养基洗涤2次,以1×107cells/cm2密度接种于培养瓶孵育。2天后半量换液,4天时完全换液,弃去未贴壁细胞,贴壁细胞继续培养,以后每2~3天换液1次,10天后当细胞融合时,用胰蛋白酶消化传代。定期观察细胞的生长情况,细胞传至第4代后用流式细胞仪分析CD34、CD29的表达情况。2.MSCs诱导分化:选取状态较稳定的第4代细胞,分别用含10%胎牛血清和2%胎牛血清的诱导液(终浓度为10ng/mlVEGF、2ng/mlbFGF的DMEM培养液)继续培养,每3~4天换液一次,细胞融合时,胰蛋白酶消化传代,于第7、14天用流式细胞仪分析CD34的表达情况,免疫组化法观察FVIII的表达情况。3.MSCs移植治疗实验性大鼠股动脉闭塞症:选取0.2kg左右Wistar大鼠20只,其中的2只取双下肢股四头肌和腓长肌做HE染色作为正常肌肉对照,剩余的18只结扎并断离双侧股动脉,复制成大鼠股动脉闭塞症模型。模型中的6只大鼠分别在左侧后肢局部缺血肌肉(股四头肌和腓长肌)通过多点注射的方法注射A液(生理盐水)1 ml(A组),按同样的方法右侧注射B液(培养扩增后BrdU标记的1×106cells/ml的MSCs悬液)1 ml(B组);按同样方法另外6只大鼠分别在左侧注射C液(培养扩增后BrdU标记的1×106cells/ml的MSCs与100ng/mlVEGF+100ng/ml bFGF诱导因子悬液)1ml(C组),右侧注射A液1 ml(A组);最后6只大鼠左侧注射B液1ml(B组),右侧注射C液1ml(C组)。分别在移植的第7、14天处死大鼠,取双下肢缺血部位肌肉做HE染色、免疫组织化学(FVIII、BrdU)检测。结果:1. MSCs的分离培养、扩增与鉴定:细胞接种4d后首次完全换液,弃去未贴壁的细胞,贴壁的细胞即为MSCs,此细胞形态长梭形,类似成纤维细胞,呈团、簇状分布。10d时细胞贴满瓶底,此时呈鱼群样、漩涡状、辐射状或网状排列。传代后细胞增殖迅速,一般2~3天可传一代。流式细胞术分析MSCs结果显示,CD34阳性率为1.01±0.56%、CD29阳性率为97.32±2.77%。2.两种诱导液诱导效果的比较:10%胎牛血清诱导体系,14d后免疫组织化学法检测FVIII的表达,细胞的阳性率为12.21±2.32%;而2%胎牛血清诱导体系, 14d后检测FVIII的表达,细胞的阳性率为91.43±6.32%,后者明显高于前者( p<0.01)。3.血管内皮细胞的鉴定:经2%胎牛血清诱导体系诱导的MSCs分别于第7d、14d用流式细胞术和免疫组织化学法分析CD34和FVIII的表达情况,结果见表1。诱导后CD34和FVIII阳性的细胞仍呈长梭形,但顺应性增加,呈铺路石样排列。表1.不同诱导时间CD34和FVIII的表达情况4. MSCs单独或与必要的诱导因子组合血管再生作用比较:(1)移植后7d免疫组化染色发现,血管壁周围B组和C组有BrdU阳性的血管内皮细胞,而A组无此细胞。(2)移植后14d免疫组化染色发现,肌束间B组、C组有BrdU阳性的血管,而A组无BrdU阳性的血管。(3)平均每视野FVIII染色阳性的血管数目:A组为2.8±0.6个/HP,B组为8.4±2.3个/HP,C组为12.6±2.9个/HP;B组明显高于A组( p<0.01),C组明显高于B组( p<0.05)。结论:1.骨髓间充质干细胞可以向血管内皮细胞方向分化,说明骨髓间充质干细胞具有向本胚层纵向分化的潜能。2.就诱导效果而言,2%胎牛血清诱导体系明显好于10%胎牛血清诱导体系,说明低浓度的胎牛血清更有利于MSCs向血管内皮细胞分化。3.在体外扩增的MSCs移植于缺血的活体组织可以发育成血管,从而改善缺血部位的血液循环。4.无论是MSCs单独移植还是与必要的诱导因子组合移植其血管再生作用都超过大鼠自身在缺血环境中的血管重建或再生。但MSCs与必要的诱导因子组合的血管再生作用明显超过MSCs单独移植。