胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacter/erium carotovorum subsp.carotovorum,以下简称Pcc)寄主广泛,是引起多种经济作物及观赏性植物的细菌性软腐病的重要病原菌。目前尚缺少有效的防控方法,从而造成严重的经济损失。因此,近年来从分子生物学上对Pcc致病性的相关研究逐渐深入,以期为提出理想的防治方法提供依据。多胺广泛存在于动植物和微生物中,是正常细胞生长必需的一类以碳为骨架的天然脂肪族胺类物质。在生物体内的条件下,多胺以聚阳离子形态存在,且带正电荷,能与带负电荷的蛋白质、核酸等生物大分子带负电荷互作并影响生物体的各种生理功能,如DNA的转录和翻译、核酸的稳定性、细胞生长和繁殖、膜的稳定性等。微生物中多胺特异转运系统是亚精胺/腐胺ABC转运系统,包括pot4BCD系统和potFGHI系统。高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)具有分离效能高、灵敏度高、应用范围广、分析速度快等优点,在物质分离、分析、纯化等研究领域应用越来越广泛。用HPLC分析多胺的方法的运用越来越普遍,尤其是在动物、植物、环境、食物等的多胺含量。然而,在微生物尤其是细菌中用HPLC分析多胺的方法所报道文献并不多见。本研究通过从样品制备、流动相与流动相的选择与比例调整、检测波长的选择、流速和柱温的调整等方面优化,建立了 Pcc中腐胺HPLC检测方法。为Pcc中参与多胺转运、合成相关基因的功能分析、研究提供支持。结果表明:以Agilent C18为分离柱(150 mm × 4.6 mm,5 μm),柱温30 ℃;苯甲酰氯为衍生化试剂,添加量为100 μL(样品量为1 mL);甲醇与水为流动相,采用梯度洗脱;检测波长为254 nm,建立腐胺HPLC检测标准曲线和Pcc中腐胺检测。为了阐明相应多胺代谢编码基因的功能,本研究利用同源重组方法得到三株突变体ΔpotA、ΔpotD、ΔspeE,并进行致病性、相关水解酶类、生长曲线等表型测定。结果表明:与PccS1相比,ΔpotA、ΔpotD、ΔspeE三株突变体的致病能力、产生蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、碳青霉烯抗生素等方面的能力、生长速率等表型均没有变化。表明PccS1中几个与多胺代谢相关基因poA(PC1-2235)、potD(PC1-1859)、speE(PC1-3129)对致病性不具关键作用。本实验室前期得到腐胺代谢相关基因缺失突变体ΔpotF、ΔpotG、ΔpotH、ΔpotI,其中ΔpotG致病能力显著下降。本研究利用上述HPLC腐胺检测方法对这些菌株胞内腐胺进行了检测,结果表明,与野生型PccS1相比,ΔpotF、ΔpotG、ΔpotH、ΔpotI胞内腐胺水平没有明显差异。说明potFGHI腐胺转运系统在Pcc的腐胺代谢中并非必不可缺,是否存在相同功能的转运系统,需进一步研究。