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研究背景多氯联苯(Polychlorinated biphenyls, PCBs)是一类包括209个化合物的持久性环境污染物,因其特殊的理化性质曾经广泛用于液压油、润滑油、绝缘油和传热油等产品中。在数十年的生产和使用过程中因蓄积与迁移作用造成了“全球性环境污染”。自1929至1970年代后期PCBs的全球累计产量约为100万吨,其中一半以上已进入垃圾堆放场或被填埋。中国于1965年至1974年生产了约1万吨PCBs,产品分布遍及全国。这些含PCBs的产品不可避免地污染了人类生存的环境。尽管各国立法禁止生产和运输PCBs超过30年,但其化学稳定性使其在环境中难以降解,同时含PCBs的某些废旧产品的回收和处理可造成PCBs的集中排放,因此至今仍存在一定的环境与人体负荷。在各国立法禁止PCBs商业应用之前,PCBs多以含数十种氯化程度不等的同系物的混合物形式应用及排放入环境。PCBs的动物致癌性已被证实多年,但其作用机制不清,致突变性的未得到系统研究。最近具有二恶英类似结构的PCBs已被确认为人类致癌物,其作用主要通过激活芳烃受体。低氯化PCBs代谢速率相对较高,且国内外环境的空气及水体中都发现多种低氯化PCBs以不同浓度存在,美国环境科学研究院已根据现有动物与细胞试验资料推测一氯和二氯联苯可能经一定代谢活化具有较强的致突变性,但该假说迄今尚无直接的实验数据支持。1-羟甲基芘(1-HMP)是羟甲基多环芳烃衍生而来的一种芳醇,也是肝致癌物1-甲基芘(1-MP)的主要代谢产物。1-HMP在硫酸基转移酶(SULT)的作用下可进一步代谢为具有亲电子活性的代谢物,后者已于最近在小鼠体内试验中证实为1-磺基甲基芘(1-SMP)。然而,1-HMP的诱变性迄今未有报道。目的人类生物转化酶CYP2E1是苯及其羟化产物的活化酶,而多氯联苯的化学结构与苯的羟化代谢物有一定相似度。本研究第一部分拟验证人CYP2E1活化一氯和二氯联苯化合物的可能性,以了解其相关的遗传毒性；第二部分则探讨人SULT1A1代谢活化条件下1-HMP的遗传毒作用。方法1：通过MTT法观察用一定浓度的受试物PCBs或1-HMP处理12h,并继续培养12h后,中国大鼠肺(V79)细胞和重组表达人CYP2E1和人SULT1A1的V79细胞(V79-hCYP2E1-hSULT1A1)的生长情况,以反映其代谢相关的细胞毒性。2：用体外微核试验观察一定浓度的受试物PCBs(包括2-单氯联苯、3-单氯联苯、4-单氯联苯、2,2’-二氯联苯、2,3-二氯联苯、2,4-二氯联苯、2,4’-二氯联苯、2,5-二氯联苯、2,6-二氯联苯、3,3’-二氯联苯、3,4-二氯联苯、3,5-二氯联苯、4,4’-二氯联苯)和1-HMP对上述细胞染毒12h、继续培养12h后,微核细胞率的变化,以反映受试物经代谢活化后诱导真核细胞染色体畸变的作用。3：用Hprt位点正向突变试验观察用各个PCB化合物和1-HMP诱发V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞的基因突变情况(与对V79细胞作用的结果相比较),以反映各受试物代谢相关的致突变性。4：在上述实验条件下,以1-氨基苯三唑(1-aminobenzotriazole,ABT, CYP2E1抑制剂)和五氯酚(pentachlorophenol,PCP, SULT1A1抑制剂)分别与各受试物联合处理受试细胞,以观察这两种酶与各受试物作用的关系。5：通过比较各PCB化合物的化学结构与其诱发细胞微核效能的对应关系,找出决定10个受试二氯联苯中高效能化合物的结构特征。6：统计学分析：对MTT细胞毒性试验结果采用方差分析法(n=6),微核试验结果采用卡方检验,致突变试验结果则采用Fisher确切概率法。结果1.受试物代谢依赖性细胞毒作用1.1一氯、二氯联苯对细胞的作用所有受试PCBs在10—100μM浓度范围对V79对照细胞均无细胞毒作用。然而PCB4、PCB5、PCB11在最高浓度(1001μM)对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞具有细胞毒作用(细胞数减少,p<0.05)。PCB10单独对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞没有毒作用,但在与PCP联合暴露时具有一定细胞毒作用。以0.2%(v：v)乙醇预处理该细胞系则对上述PCBs的细胞毒作用具有一定增强效应。1.21-羟甲基芘对细胞的作用1-HMP (1—8μM)对V79对照细胞的生长无影响,然而它对V79-hCYP2El-hSULT1A1细胞在最高浓度明显抑制细胞的生长(p<0.05)。与SULT1A1抑制剂PCP的联合暴露则导致1-HMP的作用明显降低。可见人SULT1A1对1-HMP的代谢活化可导致细胞毒作用。2.受试物诱发细胞微核的作用及其代谢依赖性2.1一氯、二氯联苯对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞诱发微核的作用所有受试PCBs化合物对V79对照细胞均不诱发微核,然而它们中除PCB1外,均对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞系诱发的微核(至少一个剂量组p<0.05)。其中PCB4, PCB5, PCB7, PCB8, PCB10, PCB11的作用具有浓度依赖性,其余PCBs则作用效能较低。ABT (20μM)可显著降低各个化合物的作用(p<0.05),而PCP仅对PCB8的作用具有影响(增强作用),而对其它化合物的作用无影响。2.21-羟甲基芘诱发V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞微核的作用1-HMP对V79对照细胞的微核细胞率无影响(1-8μM),但是对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞明显诱导微核,且呈浓度依赖性；PCP则几乎完全抑制了1-羟甲基芘诱导细胞微核的作用。3.受试物诱发细胞Hprt位点正向突变的作用3.1一氯、二氯联苯诱发细胞基因突变的作用选用PCB5、PCB8、PCB10和PCB11作为代表性二氯联苯化合物测试其诱发V79-hCYP2E1-hSULTlA1细胞基因突变的效应(同时采用PCP抑制SULT1A1活性)。结果显示四个受试物均诱发基因突变,且呈浓度依赖性；其中,PCB5和PCB10的作用的效能明显高于另两个化合物。3.21-羟甲基芘对细胞的基因突变的结果1-HMP (0.5—4μM)对V79对照细胞的基因突变率无影响(p>0.05)；然而它对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞强烈诱导基因突变,且作用呈浓度依赖性；PCP同时处理则明显降低其基因突变率。与基因致突变试验平行的细胞毒性试验也呈现相似改变：1-HMP对V79对照细胞的生长无影响,而对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞具有明显细胞毒性,呈浓度依赖性；PCP的同时暴露则完全抑制其细胞毒性。结果表明1-HMP的致突变作用依赖于人SULT1A1的代谢活化作用。4.二氯联苯诱发细胞微核的结构活性-分析10个二氯联苯中,PCB4、PCB5、PCB7、PCB8、PCB10、PCB11这6个PCBs诱发细胞微核作用的效能较高(并存在明显的浓度-效应关系),其中多数(除PCB11外)在苯环连接键的邻位存在一个或二个氯取代基结构。而在诱发微核作用效能较弱的4个受试物中,除PCB9外其它三个化合物都不具有邻位氯取代基,而是在间位或对位含氯。这提示邻位氯取代结构可能与二氯联苯经CYP2E1活跃的代谢活化作用有关。结论1.本研究首次发现人CYP2E1具有对PCBs进行代谢活化的作用,而人SULT1A1对多数PCBs的活化代谢物没有明显的灭活作用。2.一氯、二氯联苯化合物经人CYP2E1代谢活化后可诱发细胞染色体畸变及基因突变。3.由人CYP2E1代谢活化受试PCBs所产生的遗传毒性,总体上强的遗传毒性代谢物主要由部分二氯联苯代谢而来,相反,一氯联苯的遗传毒性相对较弱。4.苯环连接键的邻位含一个或二个氯取代基的二氯联苯可能具有较强的CYP2E1代谢依赖性遗传毒作用；而对位或间位含氯者往往与较低的遗传毒性有关。5.人SULT1A1活化1-HMP后可对真核细胞产生较强的细胞毒性和遗传毒性,后者包括染色体畸变(由微核形成所提示)和基因突变。